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實(shí)驗(yàn)方法原理    
試劑、試劑盒    純化的鼠肝細(xì)胞質(zhì)膜部分純化的胰島素受體純化的胰島素受體[125I] 胰島素豬胰島素雙琥珀酰亞胺酰辛二酸二甲亞砜NH4Cl甘油SDS-PAGE 樣品緩沖液
儀器、耗材    蛋白質(zhì)凝膠電泳裝置干膠器
實(shí)驗(yàn)步驟    
材料與設(shè)備

純化的鼠肝細(xì)胞質(zhì)膜（見本單元實(shí)驗(yàn) 1)

部分純化的胰島素受體，得自 WGA-瓊脂糖柱層析（見本單元實(shí)驗(yàn) 3)

純化的胰島素受體，得自胰島素瓊脂糖柱層析（見本單元實(shí)驗(yàn) 4)

[125I] 胰島素（受體級(jí)）（DuPont NEN NEX 196)

豬胰島素（17.5umol/L)(如，Sigma Chemical Co.13505)

雙琥珀酰亞胺酰辛二酸（Pierce Chemical Co.21555)

二甲亞砜（DMSO)

NH4Cl(1mol/L)

甘油（10%;v/v)

蛋白質(zhì)凝膠電泳裝置（BioRad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)

干膠器 (Bio-Rad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)

試劑

SDS-PAGE 樣品緩沖液（5x)

(配方，見“試劑的配制”，pp.234~240)

操作程序

1）建立如下反應(yīng)體系:

2) 反應(yīng)混合物于室溫孵育 2 h。

3) 溶雙琥珀酰亞胺酰辛二酸于 DMSO 中，使終濃度為 10 mmol/L。

4) 每管加入 6ul 10 mmol/L 雙琥珀酰亞胺酰辛二酸，室溫孵育 1 min。

5) 加1ul 1mol/L NH4Cl 終止反應(yīng)。

6) 加 15ul 5xSDS-PAGE 樣品緩沖液。

7) 樣品煮沸 5 min。

8) 加樣至 7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上。170V 電壓下電泳，至染料前沿跑出凝膠。（關(guān)于 SDS-PAGE 的詳細(xì)資料，見附錄 5)

9) 將凝膠置 10% 甘油中孵育后，在干膠器上干燥。
注：蛋白質(zhì)也可轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，如本單元實(shí)驗(yàn) 6 所述。

10）用放射自顯影法鑒定親和標(biāo)記的胰島素受體。

結(jié)果

交聯(lián)實(shí)驗(yàn)的典型結(jié)果如圖 4-6 所示。