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大鼠乳鼠成骨細胞培養(yǎng)實驗
閱讀：560 發(fā)布時間：2019-2-13實驗方法原理
取材于出生2~3 d 小鼠顱骨，以含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，采用膠原酶消化法分離成骨細胞，并進行細胞接種與傳代。采用膠原酶消化法分離培養(yǎng)成骨細胞是一種可靠、簡便、快速的細胞原代分離培養(yǎng)方法。
實驗材料SD大鼠
試劑、試劑盒F12 *培養(yǎng)液胰蛋白酶Ⅱ型膠原酶酒精
儀器、耗材手術器械磁力攪拌器
實驗步驟
一、實驗步驟
1. 拉頸處死24 小時內新生的SD大鼠，75%乙醇浸泡5 min，取出頭蓋骨，分離頂骨和額骨，冰生理鹽水液反復洗滌大鼠乳鼠顱蓋骨標本除去脂肪組織及殘留血，放入另一盛有F12 *培基液的培養(yǎng)皿中再洗滌， 將顱骨剪成2～5 mm2 碎片，將洗滌過的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 預消化15 min，以清除纖維組織細胞，棄去上清液(其中主要含成纖維細胞)。
2. 然后以0.1% Ⅱ型膠原酶10 ml，在37℃環(huán)境中消化 20 分鐘，室溫下磁力攪拌消化20 分鐘。靜置數(shù)分鐘，收集消化液，室溫下以1200 rpm離心10 分鐘。去除上清液，用20% 胎牛血清的F12 培養(yǎng)液4 ml 懸 浮細胞，接種于75 ml 培養(yǎng)瓶中，補培養(yǎng)液8 ml 使每瓶液體量達到12 ml；對靜置后沉淀部分可再重復以膠原酶消化20 分鐘、磁力攪拌消化15 分鐘、離心10 分鐘，將獲得的3 瓶細胞放置于二氧化碳培養(yǎng)箱，在5% CO2，95%空氣，37℃溫度下培養(yǎng)，24 小時后可見細胞貼壁生長，胞質開始伸展，換新鮮培養(yǎng)液，以后每隔48 小時換培養(yǎng)液(注：消化視具體情況而定，也可多消化 1 遍)。
3. 原代培養(yǎng)一般接種后第7 天能長滿。傳代時，取生長良好、貼壁松緊適度的成骨細胞 1 瓶，棄去培養(yǎng) 液，傳代時先以 PBS 沖洗 2 遍，加 0.25%胰酶1 ml，室溫下消化3～5 分鐘，將胰蛋白酶液棄去，加 F12 培養(yǎng)液充分吹打8-10 分鐘。將已消化的細胞收集、合并，計數(shù)；用 F12 *培基調節(jié)至細胞濃度為合適濃 度。一般取2-5 代成骨細胞進行實驗。代數(shù)太多，細胞老化或者分化明顯。
二、結果
如圖所示，成骨細胞的形狀和成纖維細胞非常相似，但是不同的是，比成纖維細胞更不容易消化，尤 其是傳代次數(shù)多，細胞老化的時候，非常難消化，并且不易消化成單個細胞。
圖1：成骨細胞
圖2：成骨細胞100倍
圖3：成骨細胞形成的礦化結節(jié)
三、鑒定的方法
1. 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測
2. 骨玻璃樣蛋白(BGP)檢測
3. 礦化結節(jié)檢測
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注意事項
1. 自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行。
2. 在超凈臺中，組織細胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。
3. 凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞蓋住，以防止細菌落入。
4. 操作前要洗手，進入超凈工作臺后要用75％酒精或0.2％新潔爾滅擦拭手。試劑瓶口也要擦拭。
5. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼。金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，且冷卻后才能夾取組織。吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。
6. 操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。
7. 不能用手觸及消毒器皿的工作部分，工作臺面上的用品擺放要布局合理。
8. 瓶子開口后要盡量保持45°斜位。
9. 吸溶液的吸管等不能混用。
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其他
一、討論
成骨細胞包繞在硬組織中，致使處理困難，可采用骨組織塊法、酶消化法、骨膜組織塊法、 骨髓培養(yǎng)法以及薄層骨片經(jīng) EDTA 處理并經(jīng)膠原酶消化，均可培養(yǎng)出成骨細胞。體外培養(yǎng)的成骨細胞保持 有骨組織細胞的某些特征。據(jù)文獻報道，不同方法培養(yǎng)的成骨細胞形態(tài)是不同的[1]。
二、文獻
[1] 司徒鎮(zhèn)強. 細胞培養(yǎng) [M]. 版. 西安. 世界圖書出版社西安公司, 2000:115.