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定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)
定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)有廣義概念和狹義概念。廣義概念的定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進(jìn)行PCR起始模板量的定量。
廣義概念下的定量PCR技術(shù)可以分為五種類型：
（1）外參法+終產(chǎn)物分析。所謂“外參法”是指樣本與陽性參照在兩個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)反應(yīng)。這種類型沒有對樣本進(jìn)行質(zhì)控監(jiān)測，易出現(xiàn)假陰假陽結(jié)果，沒有監(jiān)測擴(kuò)增效率，定量不準(zhǔn)。 
（2）內(nèi)參法+終產(chǎn)物分析。所謂“內(nèi)參法”是指樣本與陽性參照在一個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)反應(yīng)。這種類型對樣本進(jìn)行質(zhì)控監(jiān)測，排除假陰結(jié)果，但是定量不準(zhǔn)。
（3）外標(biāo)法+過程監(jiān)測。這種類型監(jiān)測擴(kuò)增效率，陽性樣本定量準(zhǔn)，但是無法排除假陰結(jié)果。
（4）內(nèi)參法+過程監(jiān)測。由于樣本與陽性參照在一個(gè)容器內(nèi)反應(yīng)，用同樣的Taq酶和反應(yīng)參與物，存在竟?fàn)幮砸种?，起始模板量濃度高的反?yīng)會抑制起始模板量濃度低的反應(yīng)，所以定量不準(zhǔn)。
（5）外標(biāo)法+過程監(jiān)測+內(nèi)對照。這種類型監(jiān)測擴(kuò)增效率，陽性樣本定量準(zhǔn)，同時(shí)排除假陰結(jié)果。這種類型是應(yīng)該提倡的。PCR過程的監(jiān)測有多種檢測模式。常用的有三種檢測模式：
（1）R Green I 檢測模式。溫度循環(huán)為94—55—72°C三步法，只有引物，無探針，熒光染料鑲嵌在雙股螺旋鏈中間。通過對特定方向的強(qiáng)熒光檢測獲得信號，這種試劑檢測模式易產(chǎn)生非特異信號，且本底光較大。
（2）解探針模式（Taqman）Hydrolysis Probe 。溫度循環(huán)為94—60°C二步法，不僅有引物，還有另外一個(gè)特異針對擴(kuò)增模板的探針在引物對之間。在探針相鄰兩個(gè)堿基上分別結(jié)合兩個(gè)熒光染料，一個(gè)染料接受激發(fā)光得到的能量傳給了第二個(gè)染料，接受能量的第二個(gè)染料通過發(fā)射特征光子回到穩(wěn)定態(tài)。當(dāng)Taq酶在60°C延伸擴(kuò)增鏈時(shí)，遇到探針，利用Taq酶5`—3`外切酶活性將探針?biāo)獬蓡蝹€(gè)堿基，單個(gè)堿基之間距離較遠(yuǎn)，個(gè)染料的能量無法傳給第二個(gè)染料，只好通過發(fā)射特征光子回到穩(wěn)定態(tài)，通過對溶液中個(gè)染料的熒光檢測獲得信號。這種試劑檢測模式增加了檢測信號的特異性，但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般試劑廠家只給Taq酶的聚合酶活性定標(biāo)，沒有同時(shí)給Taq酶5`—3`外切酶活性定標(biāo)，不同批號試劑之間會給定量帶來差異。另外對探針的熔點(diǎn)溫度（Tm）僅要求其高于60°C，這就使不同試劑盒之間的特異性參差不齊，而且無法做質(zhì)控檢測。
（3）雜交探針（Hybridization Probes）模式。溫度循環(huán)為94—55—72°C三步法，有引物，二個(gè)特異針對擴(kuò)增模板相鄰的探針在引物對之間，在一個(gè)探針3`堿基上結(jié)合一個(gè)熒光染料，在另一個(gè)探針5`堿基上結(jié)合第二個(gè)熒光染料。在55°C時(shí)，兩個(gè)探針都剛好接合在模板上，個(gè)染料接受激發(fā)光得到的能量傳給了第二個(gè)染料，接受能量的第二個(gè)染料通過發(fā)射特征光子回到穩(wěn)定態(tài)，通過對結(jié)合在擴(kuò)增模板上雙探針中第二個(gè)染料的熒光檢測獲得信號。這種試劑檢測模式中熒光信號與特定雜交溫度相關(guān)，探針的濃度始終保持不變，因此可以在擴(kuò)增后檢測熔解曲線作為信號的特異性質(zhì)控。另外這種試劑檢測模式可以用于點(diǎn)突變檢測。
狹義概念的定量PCR技術(shù)（嚴(yán)格意義的定量PCR技術(shù)）是指用外標(biāo)法（熒光雜交探針保證特異性）通過監(jiān)測PCR過程（監(jiān)測擴(kuò)增效率）達(dá)到定量起始模板數(shù)的目的，同時(shí)以內(nèi)對照有效排除假陰性結(jié)果(擴(kuò)增效率為零)。在國家沒有出臺陰陽判定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，所用PCR系統(tǒng)靈敏度達(dá)到一個(gè)拷貝（一個(gè)病毒）。從理論上說，只要有一個(gè)拷貝數(shù)，樣本就算陽性；一個(gè)拷貝數(shù)都沒有才算陰性。