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引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：

??1、引物長度： 5-30bp，常用為20bp左右。

??2、引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至0kb的片段。

??3、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

??4、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

??5、引物3'端的堿基，特別是末及倒數(shù)二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

??6、引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

??7、引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

??引物量：每條引物的濃度0.～umol或0～00pmol，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。