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備受矚目的2024年第115屆美國癌癥研究協(xié)會（AACR）年會于4月5-10日在美國圣地亞哥召開。今年的大會以“激勵科學·推動進步·革新診療"為主題，旨在匯聚全球腫瘤研究領域的頂尖專家學者，共同探討腫瘤早期研究與創(chuàng)新進展。

布魯克細胞分析旗下的單細胞光導系統(tǒng)和單細胞功能蛋白組學平臺，在本次會議展示的研究項目中扮演了重要角色。這些技術(shù)已經(jīng)被應用于諸多科研實踐之中，攜手全球的科學家及生物技術(shù)令居企業(yè)，共同推進新型腫瘤治療策略的研發(fā)。借助單細胞層面的功能特性分析，深挖腫瘤科學的位置領域，促進精準醫(yī)療與個性化治療方案的發(fā)展。

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DKFZ 德國癌癥研究中心

利用布魯克單細胞光導系統(tǒng)鑒定腫瘤特異性T細胞用于個體化T細胞療法開發(fā)

相比于CAR-T和腫瘤進入淋巴細胞療法，TCR-T細胞可能在體內(nèi)表現(xiàn)更長的持久性，并可以介導持續(xù)的抗腫瘤作用。此外，TCR-T細胞能夠靶向CAR-T細胞無法接觸的細胞內(nèi)抗原，從而擴大了免疫治療的潛在靶點范圍。這項研究的目標是鑒定針對自體骨髓瘤細胞的TCR。

研究者使用布魯克細胞分析的單細胞光導平臺識別腫瘤反應性T細胞，OptoSelect 1500芯片上同時對多達1500個單獨的T細胞/靶細胞相互作用進行功能分析（Beacon Quest單細胞光導系統(tǒng)搭載的OptoSelect 3500芯片可實現(xiàn)更高通量T細胞功能研究）。通過檢測分泌的細胞因子（IFNγ、TNFα、IL2）和4-1BB (CD137) 表面表達測定來鑒定反應性T細胞。在每位骨髓瘤患者中檢測到顯示出各種細胞因子分泌模式和4-1BB表達譜的腫瘤反應性T細胞。腫瘤反應性T細胞被以單細胞的形式分離出來，并對它們的TCR進行測序。將腫瘤反應性T細胞的TCR序列映射到來自同一患者的T細胞的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)，以揭示骨髓瘤反應性T細胞的基因表達特征。反應性T細胞的TCR基因被克隆并在自體T細胞中過表達，用于腫瘤衍生新表位特異性的功能驗證和分析。

綜上所述，該研究團隊提出了一種創(chuàng)新方法，能夠有效識別骨髓瘤特異性T細胞，并從中發(fā)掘出適用于個體化T細胞治療的真正具有腫瘤反應性的TCR，為個體化腫瘤免疫治療提供了新的突破性路徑。

圖1. 布魯克細胞分析的單細胞光導系統(tǒng)T細胞功能表征示意圖

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Biocytogen Pharmaceuticals 百奧賽圖

開發(fā)靶向突變KRAS蛋白的新型TCR-mimic全人抗體

突變型KRAS蛋白因其在多種實體瘤中頻繁而特異性的表達特征，成為了吸引力的癌癥治療靶點。特別是在人類結(jié)直腸癌和胰腺導管腺癌中，相當大比例的病例存在腫瘤驅(qū)動的KRAS基因G12V/G12D突變，然而目前尚未有針對這兩種突變的有效藥物，凸顯出臨床上亟待填補的巨大需求缺口。盡管小分子藥物難以直接靶向KRAS G12V/G12D突變，但TCR類似物（TCR-mimic）抗體卻展現(xiàn)出了針對性識別由人類白細胞抗原（HLA）呈遞的KRAS突變的能力，從而為攻克這類細胞內(nèi)抗原開辟了全新的途徑。

在此項研究中，科研人員利用百奧賽圖公司的RenTCR-mimicTM小鼠模型進行免疫，并結(jié)合基于Beacon單細胞光導技術(shù)的高通量篩選平臺，成功鑒定出了一批對G12V/HLA和G12D/HLA復合物具有特異性的新型抗體。相較于天然存在的內(nèi)源性TCR，這些TCRm抗體具有更強的親和力，有助于降低腫瘤逃避免疫監(jiān)視的風險。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，這些抗體具有高度的序列多樣性和可能的不同表位靶向性。值得注意的是，盡管胰腺癌因其治療難度大、細胞表面KRAS突變肽-HLA復合物表達量極低，但當這些TCRm抗體組裝成為CD3 T細胞接合器后，仍然在體外實驗中展現(xiàn)了強大的腫瘤殺傷活性。此外，這些抗體還通過嚴格的測試，證明了的安全性，避免了非特異性靶向。

總結(jié)而言，本研究揭示了這些針對KRAS突變靶點的TCRm抗體在實體瘤治療領域具有廣闊的應用前景和顯著的治療潛力。

圖片來源：百奧賽圖

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維克森林大學醫(yī)學院

患者來源腫瘤芯片培養(yǎng)增強針對原發(fā)性腫瘤細胞的適應性免疫反應

研究者們設計了一種創(chuàng)新的3D Tumor On Chip（TOC）平臺，該平臺能夠模擬真實的腫瘤微環(huán)境，并利用微流控技術(shù)實現(xiàn)患者來源腫瘤類器官與自體外周血單核細胞（PBMC）共培養(yǎng)。在該裝置中，PBMCs經(jīng)歷連續(xù)循環(huán)，直接接觸由患者自身腫瘤衍生的多克隆新抗原，進而促使這些PBMC轉(zhuǎn)化為具有高度針對性和抗腫瘤活性的類器官相互作用淋巴細胞（OIL）。

為了驗證TOC平臺的有效性，研究團隊從15例手術(shù)患者中獲取了樣本材料，將患者的腫瘤細胞與自體抗原呈遞細胞在三維（3D）支架內(nèi)整合構(gòu)建出腫瘤類器官。接著，在TOC系統(tǒng)中讓自體PBMC與這類腫瘤類器官共同培養(yǎng)，以生成免疫增強型的OIL；而未經(jīng)TOC系統(tǒng)處理的PBMC以及來自腫瘤內(nèi)部的淋巴細胞作為對照組。通過采用布魯克公司的單細胞功能蛋白質(zhì)組學技術(shù)和CodePlex芯片分析，研究者對OIL及其CD8+對照細胞的功能進行了詳盡的檢測，尤其是比較它們分泌細胞因子的多功能性。結(jié)果顯示，經(jīng)過TOC系統(tǒng)訓練后的CD8+ OIL表現(xiàn)出明顯的多功能性提升，尤其是增強了效應T細胞相關的細胞因子如INF-γ、顆粒酶B和穿孔素的分泌。當將OIL與對照組一起重新引入到腫瘤細胞共培養(yǎng)體系中時，OIL分泌的促炎細胞因子IFN-γ、MCP-1及顆粒酶A顯著增多（p<0.05）。更重要的是，OIL在面對再次暴露的腫瘤細胞時，能夠有效激活細胞毒性淋巴細胞，導致腫瘤細胞死亡率顯著提高（p<0.05）。

綜上所述，與對照組相比，TOC系統(tǒng)所產(chǎn)生的OIL展現(xiàn)出了更強的細胞毒性淋巴細胞多功能性和誘導腫瘤細胞凋亡的能力，這一效果不依賴于特定的腫瘤類型。鑒于此，研究者提出了一個新的潛在的過繼細胞療法模型，有望針對目前常規(guī)療法難以攻克的多種腫瘤類型，提供更有效的個體化免疫治療方案。

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弗吉尼亞大學

使用低甲基化劑重塑大顆粒淋巴細胞白血病的表觀基因組

大顆粒淋巴細胞（LGL）白血病是一種罕見的異質(zhì)性血癌。由于尚無FDA批準的治療LGL白血病的抗腫瘤藥物，科研人員正在積極探索新的治療策略。

由于DNA高甲基化是LGL白血病的一個新興標志，研究者評估了兩種表觀遺傳藥物阿扎胞苷(AZA)和克拉屈濱(CLAD)的治療潛力，它們分別直接和間接抑制DNA高甲基化。研究者假設AZA和CLAD將1) 表現(xiàn)出細胞內(nèi)在功效，2)通過DNA低甲基化重新編程LGL白血病的表觀基因組，以使異?；虮磉_正?；?，3)誘導細胞因子介導的免疫反應。通過Cell Titer Glo活力測定在人LGL白血病細胞系中評估AZA和CLAD細胞毒性。每一種都表現(xiàn)出有效的抗白血病作用，IC50值在低微摩爾和納摩爾范圍內(nèi)。Western blotting分析表明，治療后DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的蛋白表達和磷酸化STAT3水平呈時間和劑量依賴性下降。研究者還探討了這些低甲基化藥物的免疫調(diào)節(jié)作用，因為LGL白血病是一種具有細胞毒性淋巴細胞的促炎性惡性腫瘤。使用布魯克單細胞功能蛋白組分析平臺的初步研究結(jié)果表明，AZA和CLAD誘導LGL白血病細胞產(chǎn)生抗炎細胞因子。正在進行的研究將使用AZA或CLAD處理樣本的RRBS、ATAC-seq和RNA-seq來確定差異甲基化、染色質(zhì)可及性和基因表達，以定義DNA去甲基化的機制和后果。發(fā)現(xiàn)AZA和CLAD的重編程能力可能會重新利用這些抑制劑來治療LGL白血病患者。

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羅斯威爾公園綜合癌癥中心

NK受體讓TCR介導的CTL能夠識別和殺傷表達非突變腫瘤相關抗原的癌細胞

在免疫系統(tǒng)中，樹突狀細胞（DC）在向幼稚T細胞呈遞抗原過程中扮演重要角色，其中CD28驅(qū)動的"信號2"對于有效激活T細胞反應至關重要。然而，在針對腫瘤相關抗原（TAA）的反應中，如何確保激活的殺傷性T細胞（CTL）能夠區(qū)分并針對性地攻擊癌細胞，而不是對表達同樣非突變TAA的健康細胞產(chǎn)生自身免疫反應，是一個有待深入理解的問題。由于CD8+ T細胞表達激活NK受體（NKR），并且NKR配體通常由癌細胞而非健康組織表達，因此研究者評估了DC引發(fā)的TAA特異性CTL識別癌細胞期間NKR和TCR之間的串擾。

TCGA分析顯示DNAM-1和NKG2D與瘤內(nèi)CD8+ T細胞而非NK細胞密切相關，這對于黑色素瘤患者的長期生存至關重要。與初始CD8+ T細胞相比，人DC引發(fā)的CTL顯著上調(diào)DNAM-1和NKG2D，但在癌細胞識別中保留了對TCR的嚴格依賴。出乎意料的是，DNAM-1和NKG2D的阻斷阻止了TCR介導的CTL對表達低TAA水平的癌細胞的識別和殺傷，但在識別高TAA水平表達的癌細胞時是多余的。研究者使用IsoSpark單細胞功能蛋白組分析平臺、鈣流、蛋白質(zhì)印跡和RNA測序分析NKR介導的共刺激的機制和分子效應，發(fā)現(xiàn)DNAM-1以及較小程度的NKG2D降低了TCR激活閾值并增強了近端TCR信號傳導和CTL的多功能性。TCR轉(zhuǎn)基因T細胞中的NKR過度表達或化療驅(qū)動的癌細胞上NKR配體的升高可以有效識別和殺死弱免疫原性癌細胞。NKR共刺激存在時TCR激活閾值降低，使得癌細胞上低水平的同源 MHC I-肽復合物能夠激活CTL。這些數(shù)據(jù)有助于解釋未突變的“自身"抗原在缺乏自身免疫的情況下介導腫瘤排斥的能力，并提供了增強癌癥治療有效性的新工具。

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喬治城大學

黑色素瘤腫瘤內(nèi)巨噬細胞過繼細胞療法對腫瘤微環(huán)境進行重編程

腫瘤微環(huán)境（TME）內(nèi)腫瘤細胞和免疫細胞之間的相互作用決定促腫瘤或抗腫瘤免疫反應。腫瘤相關巨噬細胞（TAM）對ME信號做出反應，并表現(xiàn)出介于M1和M2巨噬細胞之間的一系列表型。在大多數(shù)腫瘤類型中，包括黑色素瘤，M1和M2巨噬細胞之間的平衡至關重要，較高的 M1/M2 比率有利于抗腫瘤免疫。因此，提高 M1/M2 比率的策略可以顯著改變TME的抗腫瘤免疫能力。在這項研究中，我們分別通過靜脈內(nèi) (iv) 和腫瘤內(nèi)途徑將熒光素酶和表達 GFP 的M1巨噬細胞作為過繼細胞療法注射到攜帶SM1 鼠黑色素瘤腫瘤的小鼠中，以確定有效的治療方式。我們用HDAC6抑制劑對抗腫瘤M1巨噬細胞進行離體重新編程，以鎖定M1表型，并在同基因SM1小鼠黑色素瘤和人源化NSG-SGM3黑色素瘤模型中以ACT瘤內(nèi)給藥。我們對腫瘤進行了巨噬細胞標記物的組織學分析、浸潤免疫細胞的免疫表型分析、腫瘤巨噬細胞的單細胞分泌組分析以及CD45+免疫細胞群的單細胞RNA-seq分析，以證明巨噬細胞ACT的益處。其中IsoSpark單細胞功能蛋白組分析平臺對F4/80+ TAM的單細胞分泌組分析揭示了HDAC6處理的M1巨噬細胞的多功能性，可分泌炎癥細胞因子TNFα和T細胞募集趨化因子CXCL10。對腫瘤切片進行巨噬細胞表型標記物的組織學檢查表明，在SM1小鼠和NSG-SGM3黑色素瘤腫瘤模型中，移植的巨噬細胞在ACT后保留了M1表型。研究者證明了用HDAC6抑制劑離體重編程巨噬細胞作為治療實體瘤的可行巨噬細胞療法的潛力。

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伊利諾伊大學芝加哥分校

硬脂酸誘導促炎巨噬細胞反應對肺癌發(fā)展的重要性

研究團隊發(fā)現(xiàn)在可切除的早期肺癌患者中，硬脂酸（SA）和巨噬細胞炎癥蛋白1β (MIP-1β/CCL4) 水平升高可預測腫瘤影響的肺葉。研究者假設SA通過激活巨噬細胞(MΦ)和產(chǎn)CCL4等促炎細胞因子來促進肺癌發(fā)生。他們利用LC-MS對不同階段肺癌患者的血漿進行非靶向代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)早期肺癌患者的SA水平升高。為了進一步研究SA在腫瘤發(fā)生中的機制作用，用SA處理包括永生化肺上皮細胞、肺癌細胞和免疫（MΦ和T）細胞在內(nèi)的細胞系。SA的生理濃度不影響細胞活力。然而，在MΦ中，SA誘導炎癥和免疫調(diào)節(jié)基因的表達，表明SA在促進促腫瘤免疫狀態(tài)中發(fā)揮作用。此外，使用單細胞蛋白質(zhì)組分析（Isolight，Bruker Cellular Analysis，Inc）對SA刺激的MΦ的分泌組進行分析，表明多功能MΦ顯著富集，并增強了富集效應子和刺激性細胞因子的分泌。此外，源自SA刺激的MΦ的條件培養(yǎng)基導致 BEAS2B 永生化肺上皮細胞的增殖增加以及貼壁獨立生長。

這些數(shù)據(jù)表明與晚期肺癌患者相比，早期肺癌患者血漿SA水平升高。SA對MΦ的影響對于肺癌啟動至關重要，不僅增加增殖，而且誘導永生化肺上皮細胞的腫瘤轉(zhuǎn)化。此外，我們的數(shù)據(jù)表明，SA的血漿水平也可以用作肺癌發(fā)展高風險個體以及早期疾病患者的肺癌發(fā)展的潛在生物標志物。

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