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簡(jiǎn)介：抗生素曾被廣泛用于獸藥生產(chǎn)中，用于預(yù)防和治 療 疾 病 及 促 生 長(zhǎng) 劑等?？股氐臑E用終導(dǎo)致牛奶、肉類(lèi)等動(dòng)物源性食品中抗生素殘留量嚴(yán)重超標(biāo)，對(duì)人們健康帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)?？股氐臍埩魰?huì)導(dǎo)致毒副反應(yīng)，例如過(guò)敏反應(yīng)、皮疹和惡心。另外，長(zhǎng)期攝入抗生素殘留的食品，會(huì)導(dǎo)致抗藥性細(xì)菌的傳播。因此，世界各國(guó)都實(shí)施了動(dòng)物抗生素使用法規(guī)。例如，歐盟和加拿大制定了食品中藥物高殘留量（MRL），美國(guó)將其稱(chēng)為耐受水平。法規(guī)規(guī)定牛奶中抗生素殘留種類(lèi)包括磺胺類(lèi)、β內(nèi)酰胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯和四環(huán)素。本文中牛奶里各類(lèi)抗生素的*如表 1 所示。

 

本文建立了牛奶中抗生素多殘留的LC/MS/MS測(cè)定方法?？股胤N類(lèi)包括環(huán)丙沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、青霉素 G、氯唑西林、替米考星、泰樂(lè)菌素、紅霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧啶、四環(huán)素和金霉素。以及兩種同位素內(nèi)標(biāo)為環(huán)丙沙星 -d8 和氟尼辛 -d3。采用改良的 QuEChERS 方法對(duì)牛奶中抗生素進(jìn)行提取。本方法具有良好的線性，高靈敏度、回收率穩(wěn)定、重現(xiàn)性高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，滿(mǎn)足世界各國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)規(guī)定的牛奶中抗生素類(lèi)殘留*的要求。

實(shí)驗(yàn)方法：儀器設(shè)備 Perkinelmer Altus ™ UPLC® 液 相 系 統(tǒng)， 含 Altus A-30 溶 劑 管 理 模 塊、 樣 品 管 理 器 和 柱 溫 箱。 質(zhì) 譜 儀： Perkinelmer QSight ™ 210 三重四極桿質(zhì)譜儀。Simplicity 3Q ™軟件平臺(tái)控制所有儀器、采集和處理數(shù)據(jù)。方法參數(shù)液相色譜方法以及質(zhì)譜離子源參數(shù)見(jiàn)表 2。溶劑、標(biāo)準(zhǔn)物及樣品前處理所用的溶劑、試劑和稀釋液純度均為 LC/MS 級(jí)?？股貥?biāo)準(zhǔn)物購(gòu)自 Sigma-Aldrich® 公司，并于 4℃冰箱中保存。除了 β- 內(nèi)酰胺類(lèi)使用水作為溶劑外，其余抗生素均使用甲醇配制溶液。β- 內(nèi)酰胺類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液需保存于塑料瓶中，其余抗生素類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液可保存在塑料或玻璃瓶中。

從 C18 凈化劑購(gòu)于 Supelco 公司。所有母液和工作標(biāo)準(zhǔn)溶液均冷藏保存，并使用 2mL 的棕色進(jìn)樣小瓶，以防止化合物降解。同位素內(nèi)標(biāo)的使用：環(huán)丙沙星-d8用于氟喹諾酮，磺胺類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)，氟尼辛-d3用于大環(huán)內(nèi)酯和β-內(nèi)酰胺類(lèi)。

 

采用當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)得有機(jī)牛奶作為空白樣品，并對(duì)不同脂肪含量的 5 種牛奶樣品進(jìn)行抗生素殘留檢測(cè)。采用簡(jiǎn)單改良過(guò) QuEChERS 前處理方法 2,3。具體步驟如下：（1）往 5mL 空白有機(jī)牛奶（已添加標(biāo)準(zhǔn)，濃度為 15ng/mL）中加入 20mL 有機(jī)溶劑（甲醇或乙腈）；（2）渦旋混勻 1min，置于 7800rpm 下離心 10min；（3）移取上清液，加入 1.2mg 的 C18 凈化劑 ，用于除去脂肪；（4）渦旋 5min，7800rpm 下離心 5 分鐘；（5）提取 12.5mL 上清液，于 40℃用氮?dú)獯抵?1.5- 2mL；（6）用 15% 甲醇水溶液定容至 2.5mL，渦旋混勻；（7）過(guò) 0.22µm PVDF 微孔濾膜。本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，待上述步驟 7 完成后在進(jìn)行基質(zhì)配標(biāo)及添加內(nèi)標(biāo)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍在 0.1ng/ mL-1000ng/mL，每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)進(jìn)樣 5 次，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)。

 

質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)研究的目標(biāo)化合物均采用正離子模式的電噴霧模式檢測(cè)。采用蠕動(dòng)泵和液相色譜儀相結(jié)合，以三通連接的方式來(lái)優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)：如氣體流量、離子源溫度以及離子源的位置。蠕動(dòng)泵以10µL/min的流速將0.5μg/mL磺胺甲嘧啶注入質(zhì)譜，液相色譜儀以 0.5mL/min 的流速，溶液為乙腈水溶液（V/V， 10/90，含 0.1% 甲酸，5mM 甲酸銨）注入質(zhì)譜中。每個(gè)化合物均采用濃度為 0.5μg/mL 來(lái)優(yōu)化碰撞能量。Q1 和 Q3 的分辨率為 0.7amu。各個(gè)化合的質(zhì)譜參數(shù)詳見(jiàn)表 3，每個(gè)化合物均采集 3 對(duì) MRM 離子對(duì)，以降低假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。

 

結(jié)果與討論：按照上述確定的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)試，各各個(gè)抗生素的校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)及 LOQ 見(jiàn)表 4。各個(gè)抗生素的 LOQ 比法規(guī)中耐受水平還要低至 5-100 倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法*牛奶中抗生素的檢測(cè)要求。圖 1 為牛奶基質(zhì)加標(biāo)樣品（濃度為 5ng/mL）中磺胺甲嘧啶的提取離子色譜圖，從圖1可以看出，具有較高的信噪比。采用空白牛奶基質(zhì)作為稀釋液，配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（9 個(gè)濃度點(diǎn)），基質(zhì)配標(biāo)曲線范圍為 0.1-1000ng/mL。圖 2 為磺胺二甲嘧啶校準(zhǔn)曲線示例，線性范圍大于 4 個(gè)數(shù)量級(jí)。所有抗生素化合物的校準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù) R2 均大于 0.9958，具有良好的線性關(guān)系。表 5 為目標(biāo)化合物在不同濃度下連續(xù)進(jìn)樣的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)。