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摘要 ：本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)展示將 Agilent InfinityLab 二維液相色譜解決方案與 Agilent 6495 三重 四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)結(jié)合使用，分析藥代動(dòng)力學(xué)研究中的藥物及其代謝物。二維液 相色譜可避免出現(xiàn)共洗脫，因此能夠減少信號(hào)抑制以及交叉干擾風(fēng)險(xiǎn)，這些問題可 能存在于復(fù)雜樣品的一維分析中。通過以更適合的洗脫方式將分析物引入質(zhì)譜離子 源，2D-LC/MS/MS 分析方法的第二維可用于提高質(zhì)譜檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度。

 

前言 ：在過去十年間，LC/MS/MS 已成為了藥 代動(dòng)力學(xué)研究中用于分析藥物及其代謝物 的一項(xiàng)成熟技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)除高選擇性、 高分析靈敏度以及在峰歸屬或分子量信息 等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)以外，也遇到了一些 *的困難，如難以對(duì)血漿或細(xì)胞培 養(yǎng)基等基質(zhì)復(fù)雜的生物樣品進(jìn)行分析。另 外，還存在同質(zhì)異位素共洗脫或代謝物源 內(nèi)碎裂導(dǎo)致的交叉干擾，以及基質(zhì)組分共 洗脫導(dǎo)致的信號(hào)抑制等挑戰(zhàn)。信號(hào)抑制的 問題在低濃度分析物定量時(shí)尤為突出，可 能造成定量限不達(dá)標(biāo)。 就如何將 Agilent InfinityLab 二維液相色 譜解決方案與 Agilent 6495 三重四極桿液 質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)結(jié)合在生物分析研究環(huán)境中克 服上述難題，本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)詳細(xì)列舉了兩個(gè) 示例，分別是： • 二維分離方案如何避免出現(xiàn)共洗脫， 以及如何在處理復(fù)雜分析物混合物時(shí) 降低交叉干擾風(fēng)險(xiǎn)或減少信號(hào)抑制 • 如何利用第二維通過改變洗脫條件提 高質(zhì)譜檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度，從而以更適 合的洗脫液將分析物引入質(zhì)譜離子 源，大幅提高定量限 

 

實(shí)驗(yàn)部分： 設(shè)備 Agilent 1290 Infinity II 二維液相色譜系統(tǒng) 包括以下模塊： • 兩臺(tái) Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配備冷卻裝置（選件 #100） • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116B) • Agilent 1290 Infinity 閥驅(qū)動(dòng) (G1170A)，配備 2 位/4 通雙向閥 （二維液相色譜閥 1300 bar：部件號(hào) 5067-4244） • 兩個(gè) Agilent 1290 Infinity 閥驅(qū)動(dòng) (G1170A)，配備帶 40 µL 定量環(huán)的多 中心切割閥 (G4242-64000) • 質(zhì)譜 (MS) 檢測(cè)采用配備安捷倫噴射 流電噴霧離子源 (G1958-65538) 的 Agilent 6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系 統(tǒng)進(jìn)行

軟件 • Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版，版本 C.01.07 SR2 [263] 以及二 維液相色譜軟件，版本 A.01.03 [025] • Agilent MassHunter 工作站 LC/MS 數(shù)據(jù)采集軟件，版本 B.08.00，Build 8.0.8023.5 SP1 • Agilent MassHunter 工作站定量分析 軟件，版本 B.07.01，Build 7.1.524.0 

 

化學(xué)品 LC/MS 級(jí)乙腈和甲醇購(gòu)自 TH Geyer (Renningen, Germany)。LC/MS 分析所 使用的甲酸和乙酸銨購(gòu)自 Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)。 新制超純水產(chǎn)自配置 0.2 µm 膜式終端 過濾器的 ELGA Pureflex 2 水純化系統(tǒng) (Veolia Water Technologies Deutschland GmbH, Celle, Germany)。 樣品和方法 利用二維液相色譜避免信號(hào)抑制和交叉 干擾 進(jìn)行體外細(xì)胞懸液測(cè)定，鑒定負(fù)責(zé)候選藥 物代謝的關(guān)鍵酶。在細(xì)胞懸液中對(duì)候選藥 物（小分子）和多種酶特異性探針底物及 相應(yīng)酶抑制劑進(jìn)行溫育。經(jīng)過一段時(shí)間 后，收集樣品并分析代謝物的形成。為避 免信號(hào)抑制或交叉干擾，采用色譜法對(duì)高 豐度底物和抑制劑進(jìn)行了分離。進(jìn)樣溶液 中含有細(xì)胞上清液與穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo) 溶液的混合物。方法參數(shù)如表 1 所示。 二維液相色譜通過溶劑切換提高質(zhì)譜檢 測(cè)靈敏度 通過體外細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定評(píng)估母體化合物 （候選藥物）及其三種主要代謝物在培養(yǎng) 基和細(xì)胞中的濃度。在預(yù)設(shè)溫育時(shí)間結(jié)束 后采集樣品，加入非穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi) 標(biāo)，然后進(jìn)樣。方法參數(shù)如表 2 所示。

 

 結(jié)果與討論 利用二維液相色譜避免信號(hào)抑制和交叉 干擾 在酶底物和抑制劑存在的條件下，體外細(xì) 胞懸液測(cè)定得到的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中含有 各種代謝物，因此屬于復(fù)雜混合物。圖 1 所示為細(xì)胞培養(yǎng)上清液的 LC/MS/MS 分 析結(jié)果。突出顯示的代謝物 M1 與濃度更 高的底物和抑制劑發(fā)生了共洗脫。在此次 LC/MS/MS 分析中，代謝物 M1 發(fā)生信號(hào) 抑制，原因是該代謝物與豐度更高的底物 和抑制劑發(fā)生了共洗脫。對(duì)于結(jié)構(gòu)相關(guān)化 合物，還可能有交叉干擾的問題。 要避免信號(hào)抑制和交叉干擾，分析細(xì)胞上 清液時(shí)需要采用一種能夠?qū)⒋x物與底物 和抑制劑分離開來(lái)的色譜方法。