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摘要 ：本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)介紹了發(fā)酵培養(yǎng)基中氨基酸 LC/MS液質(zhì)聯(lián)用分析的解決方案。氨基酸的極性使其 難以進(jìn)行反相液相色譜分析，因此通常使用衍生化來改善其保留能力。然而，親水 相互作用色譜 (HILIC) 無需衍生化也能保留并分離復(fù)雜的氨基酸混合物，同時(shí)還具有 與傳統(tǒng)反相液相色譜類似的工作流程。HILIC 與質(zhì)譜的組合提供了一種極其簡(jiǎn)單而功 能強(qiáng)大的未衍生化氨基酸分析解決方案。

 

前言： 監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)器和發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的各種極性化合物，是親 水相互作用色譜 (HILIC) 的一種挑戰(zhàn)性實(shí)際應(yīng)用。使用高 pH 條件與負(fù)離子模式 LC/MS 檢測(cè)，可以在一次分析中實(shí)現(xiàn)對(duì)氨 基酸、原料與廢棄物的監(jiān)測(cè)。Agilent AdvanceBio MS Spent Media 的鍵合相在高 pH 流動(dòng)相下具有出色的穩(wěn)定性，非常適 合該體系的分離。 盡管基質(zhì)的分析充滿挑戰(zhàn)性，進(jìn)樣間的重現(xiàn)性仍十分優(yōu)異。中 空纖維反應(yīng)器和轉(zhuǎn)瓶反應(yīng)器的檢測(cè)結(jié)果揭示了培養(yǎng)細(xì)胞的葡萄 糖和氨基酸消耗以及乳酸分泌。

 

實(shí)驗(yàn)部分：試劑與化學(xué)品 所有試劑均為 HPLC 級(jí)或更高等級(jí)。超 LC/MS 級(jí)乙腈購自 J.T. Baker (Center Valley, PA, USA)。水的凈化處理由 EMD Millipore Milli-Q Integral 系統(tǒng) (Darmstadt, Germany) 完成。試劑級(jí)甲 酸（FA，部件號(hào) G2453-85060）來自安捷倫科技公司。甲酸 銨、乙酸銨、氫氧化銨和氨基酸標(biāo)樣購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。DMEM 培養(yǎng)基購自賽默飛 (Waltham, MA, USA)。氨基酸在使用前于 –70 °C 下儲(chǔ)存。 儀器與材料 • Agilent InfinityLab 接頭 • 色譜柱前端：Agilent Quick Connect 快速連接接頭 （部件號(hào) 5067-5965） • 色譜柱末端：Agilent Quick Turn 接頭（部件號(hào) 5067- 5966） • 安捷倫樣品瓶，螺口蓋，棕色，帶書寫簽，已認(rèn)證， 2 mL，100/包（部件號(hào) 5182-0716） • 安捷倫固定螺口蓋，PTFE/紅色硅橡膠隔墊（部件號(hào) 5190-7024） • 安捷倫樣品瓶?jī)?nèi)插管，250 µL，去活玻璃，帶聚合物支腳 （部件號(hào) 5181-8872） • Eppendorf 移液器和連續(xù)分液器 • 超速離心儀 (VWR, Radnor, PA, USA) • 渦旋儀和多管渦旋儀 (VWR, Radnor, PA, USA) • HDPE 溶劑瓶 (VWR, Radnor, PA, USA) • 轉(zhuǎn)瓶生物反應(yīng)器 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) • 中空纖維生物反應(yīng)器 (FiberCell Systems, New Market, MD, USA)

 

儀器 • Agilent 1290 Infinity II 二元泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II 樣品瓶進(jìn)樣器 (G7129B) • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116B) • Agilent 1290 Infinity 液相色譜系列超低擴(kuò)散工具包 (5067-5189) • Agilent 6545 四極桿飛行時(shí)間 (Q-TOF) 質(zhì)譜儀 • 安捷倫噴射流電噴霧離子源 軟件 Agilent MassHunter 工作站軟件 B.08.00 樣品前處理 將細(xì)胞培養(yǎng)樣品用 50% 乙腈稀釋 4 倍，并以 10000 × g 的速度 離心 10 分鐘。收集上清液并進(jìn)樣，無需進(jìn)一步樣品前處理。 流動(dòng)相 用水配制 100 mM 乙酸銨儲(chǔ)備液，并用氫氧化銨將 pH 調(diào)節(jié)至 9。 將水與儲(chǔ)備液按 9:1 稀釋制得流動(dòng)相 A。將乙腈與儲(chǔ)備液按 9:1 稀釋制得流動(dòng)相 B。兩種流動(dòng)相的乙酸銨終濃度均為 10 mM。 流動(dòng)相與玻璃器皿過度接觸會(huì)引入離子物質(zhì)，干擾并抑制質(zhì)譜 檢測(cè)。儲(chǔ)存在玻璃瓶中的流動(dòng)相應(yīng)定期更換，或轉(zhuǎn)移至 HDPE 瓶中。

結(jié)論：Spent 培養(yǎng)基中的氨基酸在 HILIC-MS的負(fù)離子模式下成功得 到了分析。通常難以分析的亮氨酸/異亮氨酸同量異位素實(shí)現(xiàn) 了基線分離，分離度為 1.6。氨基酸作為兩性離子，在正離子 和負(fù)離子模式下都容易電離，但在高 pH 負(fù)離子模式下能夠?qū)?現(xiàn)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基、原料和細(xì)胞廢棄物的同時(shí)監(jiān)測(cè)。