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摘要：目前需要通過(guò)一種超高靈敏度的定量分析方法來(lái)測(cè)定男性體內(nèi)總睪酮和游離 睪酮的濃度，尤其要能夠測(cè)定女性和兒童體內(nèi)的低濃度睪酮。因此，安捷倫 開(kāi)發(fā)了一種使用 Agilent 6495 離子漏斗質(zhì)譜儀定量分析和表征血清中睪酮的 分析方法，同時(shí)確定了適合實(shí)驗(yàn)室使用的分析方法。

 

前言：睪酮 (T) 是一種促進(jìn)男性生殖器發(fā)育 的雄性激素，與女性的雌性激素前體 類(lèi)似，它可以影響男性的第二性征。 它可以發(fā)揮同化作用，并對(duì)兩性行為 產(chǎn)生影響。循環(huán)睪酮可與性激素結(jié)合 球蛋白 (SHBG) 結(jié)合，其中小部分與白 蛋白結(jié)合，另一小部分以游離激素形 式存在。非 SHBG 結(jié)合的游離睪酮是 生物活性成分，因?yàn)榕c血清白蛋白結(jié) 合的睪酮可以自由離解。 實(shí)驗(yàn)部分 化學(xué)品與試劑 用于基質(zhì)匹配校準(zhǔn)物的人血清購(gòu)自 Golden West Biologicals (Temecula, CA)。 標(biāo)樣和內(nèi)標(biāo)購(gòu)自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO)。樣品前處理和液相色譜溶劑購(gòu) 自 Burdick & Jackson (Morristown, NJ)。

 

 樣品前處理 根據(jù)以下步驟配置樣品、校準(zhǔn)物和基 質(zhì)中的質(zhì)量控制 (QC) 物質(zhì)。 1. 將 100 µL 樣品和 5 µL 5 ng/mL 內(nèi)標(biāo) 置于試管中 2. 向每個(gè)試管中加入 2 mL HPLC 級(jí)的 3:2 乙酸乙酯/己烷，并渦旋混合 2 分鐘 3. 將有機(jī)層轉(zhuǎn)移至另一潔凈試管， 并加入 500 µL 0.1 mol/L NaOH 溶液 4. 在室溫下收集有機(jī)層并在氮?dú)庀?吹干 5. 干燥后，將樣品復(fù)溶于 100 µL 70:30 的水/甲醇中進(jìn)行分析數(shù)據(jù)分析 采用 Agilent MassHunter 采集軟件 (B.07) 進(jìn)行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集。采 用 Agilent MassHunter 定量分析軟件 (B.07) 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

 

結(jié)果與討論 線性 采用線性回歸擬合和 1/x 的加權(quán)因子得 到了不包括原點(diǎn)在內(nèi)的校準(zhǔn)曲線，從 而確定了總睪酮在 1-1000 pg/mL 濃度范 圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù) (R2 ) 平均值大于 0.998 （圖 1）。根據(jù) 10:1 的信噪比 (S/N) 測(cè)定 得到定量限 (LOQ) 為 5 pg/mL。 準(zhǔn)確度和精度 本研究得出了出色的結(jié)果，結(jié)果匯總 如表 1 所示。在 4 天的單次運(yùn)行中， 對(duì)六種濃度的 QC 樣品進(jìn)行五次分析。 表 1 顯示了每日的準(zhǔn)確度和整體精 密度。所有 QC 樣品的準(zhǔn)確度為 75%- 125%，精密度 < 13%。方法對(duì)比 將 LC/MS/MS 分析方法與經(jīng)過(guò)預(yù)先驗(yàn) 證的 ELISA 方法相比，以確保結(jié)果的 準(zhǔn)確性。采用 LC/MS/MS 分析方法和 ELISA 方法提取并分析二十五份機(jī)密 的患者樣品。表 2 列出了通過(guò)這兩種 方法得到的結(jié)果 (ng/dL) 和百分比差 異。如圖 2 所示，R2 > 0.96。

儀器對(duì)比 使用兩臺(tái) Agilent 6495 三重四極桿 LC/MS 儀器分析相同樣品并對(duì)比結(jié) 果。如圖 3 所示，R2 值 > 0.96。

 

結(jié)論 這些數(shù)據(jù)表明，該提取流程和 LC/MS/MS 分析方法可用于對(duì)低濃度 總睪酮進(jìn)行所需的定量分析。所購(gòu)買(mǎi) 基質(zhì)材料中的低濃度睪酮和其他干擾 化合物成為了限制因素，阻礙了該分 析方法檢測(cè)低濃度的睪酮。校準(zhǔn)曲線 獲得了出色的線性，并得到了高度重 現(xiàn)、準(zhǔn)確而數(shù)據(jù)。