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前言：使用液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜儀對蛋白質(zhì)進(jìn)行常規(guī)的高通量定量分析時(shí)，我 們將多肽作為相應(yīng)蛋白質(zhì)的替代物。選擇*的多肽以及適合每種目標(biāo)多肽的 MRM 離子對是分析成功的關(guān)鍵步驟。考慮到儀器質(zhì)量數(shù)范圍限制，分析時(shí)通常 不會選擇具有高 m/z 母離子或子離子的多肽。但是，若要解決生物學(xué)問題，此 類多肽也許能提供關(guān)鍵信息，甚至可能是唯yi的分析選擇。此類例子包括具有 大型疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白、帶有多種翻譯后修飾結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，以及內(nèi) 源性多肽等等。 本應(yīng)用簡報(bào)將介紹 Agilent 6495B 三重四極桿質(zhì)譜儀分析具有高 m/z 子離子的多 肽的性能，并展示將分析的質(zhì)量數(shù)范圍擴(kuò)展至 m/z 3000 帶來的優(yōu)勢。將胰蛋白 酶消解的單克隆抗體 (mAb) 標(biāo)準(zhǔn)品和 HeLa 細(xì)胞膜富集提取物分別作為簡單樣品 和復(fù)雜樣品進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)方法 蛋白質(zhì)/多肽選擇 使用 Agilent 6550 Q-TOF 質(zhì)譜儀，在數(shù) 據(jù)依賴型模式下采集抗 IL8 mAb 消解 物和 HeLa 細(xì)胞膜富集蛋白質(zhì)消解物 的 LC/MS 數(shù)據(jù)。使用 Agilent Spectrum Mill（B.05.00.181 SP1 版）比對適用的 數(shù)據(jù)庫檢索原始數(shù)據(jù)，鑒定出產(chǎn)生高 m/z 子離子的多肽，以此測試 Agilent 6495B 三重四極桿質(zhì)譜儀的性能。

 

LC/MS/MS 系統(tǒng) 將 Agilent 1290 Infinity UHPLC系統(tǒng)連 接至質(zhì)量數(shù)范圍達(dá) 3000 u 的 6495B 三 重四極桿質(zhì)譜儀。LC/MS 實(shí)驗(yàn)采用 安捷倫噴射流 (AJS) 離子源和 Agilent Poroshell 120 EC-C18, 2.1 × 100 mm 2.7 µm 色譜柱（部件號 695775-902）進(jìn)行。 使用 3.5 分鐘的 MRM 方法分析 mAb 消 解物，HeLa 細(xì)胞膜消解物則使用 21 分 鐘的 MRM 方法分析。

 

制備 mAb 消解物的稀釋系列，并將每 個(gè)進(jìn)樣濃度的信號響應(yīng)相對于 mAb 消 解物的總柱上進(jìn)樣量作圖，據(jù)此進(jìn)行 糖肽定量分析。 此外，通過將每種子離子的信號響應(yīng) 相對于對應(yīng)的柱上進(jìn)樣量作圖，執(zhí)行 HeLa 細(xì)胞膜多肽的定量分析。

結(jié)果與討論：多肽鑒定和選擇 采用抗 IL8 mAb 消解物和 HeLa 細(xì)胞膜 消解物開發(fā)多肽鑒定和 MRM 方法， 所得結(jié)果如下： 選擇來自 mAb 消解物的一種 G1F N-糖 肽和來自 HeLa 細(xì)胞膜消解物的三種 多肽（子離子質(zhì)量數(shù)范圍為 m/z 204.1 至 m/z 2429.3）進(jìn)行 LC/MS/MS 測試 （表 2）。

圖 1 和 圖 2 顯示了其中兩種多肽的 MS/MS 譜圖和優(yōu)化的 MRM 色譜圖。 MS/MS 圖中用 * 標(biāo)記出了為 MRM 方 法選擇的子離子。 糖肽會產(chǎn)生具有大型多糖鏈的高 m/z 子離子，這些子離子能夠?yàn)槎嗵堑慕Y(jié) 構(gòu)解析提供豐富信息。

在復(fù)雜樣品中，具有較高 m/z 的子離子 往往背景噪音更低或者信噪比更高。