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紫外-可見二極管陣列用于多波長動力學(xué)分析的優(yōu)勢
閱讀：989 發(fā)布時間：2022-4-14前言：采用分光光度法監(jiān)控反應(yīng)底物的減少或反應(yīng)產(chǎn)物的增加，可以跟蹤對-硝基苯基乙酸酯 (pNPA) 的水解反應(yīng)過程。監(jiān)控濃度變化的速率可以確定反應(yīng)的速率。Agilent Cary 8454 紫外-可見二極管陣列分光光度計只需 0.1 秒的時間就能夠獲得全光譜。您可以根據(jù)需要隨時從儲存的光譜數(shù)據(jù)中提取出隨時間變化的吸光度。由于包含整個波長范圍的數(shù)據(jù)是在同一個實驗里同時獲得的，因此，可以對不同波長的結(jié)果進行準(zhǔn)確的闡釋，為反應(yīng)機理的研究提供有用的信息。
采用傳統(tǒng)的掃描分光光度計，通常能夠比較方便地在單一波長或者選定的幾個波長上跟蹤反應(yīng)的動力學(xué)過程，如果反應(yīng)非?？焖伲瑒t使用分光光度計是必需的。對于 pNPA 的水解反應(yīng)過程，可以在 270 nm 下監(jiān)控 pNPA 的消耗或在405 nm 下監(jiān)控對-硝基苯酚的生成。然而，由于沒有監(jiān)控整個光譜范圍，有可能漏掉實現(xiàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確分析所必需的重要數(shù)據(jù)。除了快速、精確的測量，精確的溫度控制對于準(zhǔn)確的動力學(xué)測量也是至關(guān)重要的。根據(jù)所研究的反應(yīng)不同，僅僅 1 °C 的變化就有可能導(dǎo)致觀測到的反應(yīng)速率發(fā)生重大變化。AgilentCary 8454 提供的帕爾貼溫度控制附件（部件號 89090A）可以精確控制溫度，能夠加熱或冷卻樣品，還能利用溫度探頭測量樣品的溫度。
實驗部分：在堿性溶液中，pNPA 會按照下面的方程式水解為對-硝基苯酚：
從原理上講，這是一個二級反應(yīng)，但如果存在過量的水，則會表現(xiàn)出偽一級反應(yīng)動力學(xué)。反應(yīng)速率對 pH 值和溫度較為敏感。將 2.9 mL 的 0.1 M 磷酸緩沖液 (pH 8.5) 加入到比色皿中，然后將其放入恒溫的比色皿支架中使其達(dá)到平衡。樣品的精確溫度由一個外置溫度傳感器選件測定，該傳感器尺寸很小，有玻璃外罩以保持惰性。
環(huán)繞在樣品池周圍的鋁塊的溫度由帕爾貼溫度控制器控制。樣品池與鋁塊緊密接觸以盡可能減小溫度差異。預(yù)設(shè)溫度與樣品實際溫度之間只有很微小的差異。在比色皿中加入3 mL 蒸餾水，就可以用外置傳感器來測定不同溫度下二者之間的差異（圖 2）。盡管如此，監(jiān)控得到的溫度是通過外置傳感器測得的實際樣品的溫度，這就保證了最高的溫度精度。當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到平衡時，將 50 µL 溶于無水乙腈的對-硝基苯基乙酸酯儲備液加入比色皿開始反應(yīng)，并用攪拌器以700 rpm 的速度混合反應(yīng)物。以時間間隔自動獲取譜圖，該時間間隔是根據(jù)反應(yīng)溫度和速度進行調(diào)節(jié)。圖 3 顯示了 55 °C 時反應(yīng)體系的光譜，測量間隔為 125 秒。
如果在一定的波長范圍內(nèi)不斷重復(fù)記錄變化的吸收光譜，這些譜可能在一個或多個波長處發(fā)生交叉（圖 3）。這些交叉點稱為等消光點，它表示反應(yīng)物與產(chǎn)物之間發(fā)生的是單相反應(yīng)（也就是沒有副反應(yīng)或串連反應(yīng)）。圖 3 所顯示出的精確的等消光點表明了 Agilent Cary 8454 紫外-可見分光光度計在整個反應(yīng)時間里的光學(xué)和溫度穩(wěn)定性。
采用紫外-可見光化學(xué)工作站，您可以很容易地打開已經(jīng)收集保存的數(shù)據(jù)并在任意波長內(nèi)對數(shù)據(jù)進行重新分析。在這個例子中，在數(shù)據(jù)采集完成后，可以提取出單波長 (405 nm)下對-硝基苯酚生成過程的數(shù)據(jù)以獲得反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。在這個波長下，沒有其他組分的吸收（圖 4）。采用紫外-可見光化學(xué)工作站軟件中的動力學(xué)模式計算得到的 55 °C 時的偽一級速率常數(shù)為 1.24 x 10-3 s-1。這種動力學(xué)模式是生化分析附加模塊 (G1117AA) 的組成部分。
結(jié)論Agilent Cary 8454 可見-紫外光分光光度計是酶催化反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)分析的理想工具。本文展示了帕爾貼溫度附件在反應(yīng)溫度可靠控制方面的有效性，它使得儀器在整個動力學(xué)分析期間具有穩(wěn)定性。二極管陣列分光光度計具有許多優(yōu)點，其全光譜采樣時間僅僅只需 0.1 秒。全光譜采集功能讓用戶能夠獲得反應(yīng)相關(guān)的所有數(shù)據(jù)。它能讓用戶在數(shù)據(jù)采集之后方便快捷地在任何波長下對反應(yīng)速率進行處理。另一方面，通過監(jiān)控一定的波長范圍，光譜可用于多組分分析以確定在各個測量時間點反應(yīng)底物和產(chǎn)物的濃度。