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摘要：本實(shí)驗(yàn)采用穩(wěn)定同位素稀釋法 (SID) 和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜法 (MRM-MS) 開發(fā)了一個(gè)用于同時(shí)測(cè)定血清中載脂蛋白 A-I 和 B 的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 方法。方法聯(lián)用Agilent 1290 Infinity LC 和 Agilent 6490 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)。采用如下樣品處理過程進(jìn)行血清消化：向 0.5 µL 血清中加入 6 mol/L 尿素使蛋白變性，再加入 1 µg 胰蛋白酶生成多個(gè)載脂蛋白 A-I 和 B 的特征肽。在正常和高甘油三酯血癥血清中，都可以準(zhǔn)確測(cè)出這些特征肽。實(shí)驗(yàn)采用確定濃度、基質(zhì)匹配的混合血清樣品直接進(jìn)行校準(zhǔn)。載脂蛋白 A-I 多肽的運(yùn)行間不精密度小于 8.6%，載脂蛋白 B 多肽的運(yùn)行間不精密度小于 6.4%。總之，采用帶iFunnel 技術(shù)的 Agilent 6490 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)，只需很少量的樣品即可同時(shí)對(duì)血清載脂蛋白 A-I 和 B 進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。

前言心血管臨床研究中一個(gè)常見的主題就是血清膽gu醇、高密度和低密度脂蛋白膽gu醇（HDLc 和 LDLc）的測(cè)定。由于高密度脂蛋白 (HDL) 和低密度脂蛋白 (LDL) 顆粒存在異質(zhì)性，因此 HDLc 和 LDLc 測(cè)定的方法很難實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。由于高甘油三酯血癥樣品產(chǎn)生的干擾，這些分析的結(jié)果也時(shí)常不準(zhǔn)確。實(shí)際存在一種潛在的替代型 HDLc 和 LDLc 測(cè)定方法，即測(cè)定與其相應(yīng)的載脂蛋白。載脂蛋白 (Apo) A-I 和 B 是 HDL 和 LDL 顆粒最重要的蛋白，Apo B/Apo A-I 的比率對(duì)于臨床研究非常有價(jià)值1。本應(yīng)用簡報(bào)將探討采用 LC/MS/MS 實(shí)現(xiàn)血清 Apo A-I 和 B 的多成分定量分析。

通過聯(lián)用液相色譜與質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 測(cè)定胰dan白酶消化所得特征肽，可實(shí)現(xiàn)載脂蛋白高靈敏度、高選擇性的直接定量分析2–5。此外，LC-MS/MS 的高特異性可以防止在血脂異常血清中發(fā)生與其他類型分析一樣的干擾。實(shí)驗(yàn)采用 Agilent 1290 Infinity LC 系統(tǒng)和帶iFunnel 技術(shù)的 6490 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)，開發(fā)了用于 Apo A-I 和 B 定量的 LC-MS/MS分析方法。此方法僅使用少量樣品 (0.5 µL)，即可分析來自 Apo A-I 和 B 以及潛在其他載脂蛋白的多種特征肽。

實(shí)驗(yàn)部分樣品制備采用 pH 8 的 50 mmol/L 碳酸氫銨 (ABC) 溶液將人血清樣品稀釋 28 倍 (5 µL + 135 µL)。采用 6 mol/L 尿素溶液將載脂蛋白從脂蛋白顆粒中溶出并使之變性。采用 9.1 mmol/L二硫蘇糖醇 (DTT) 溶液還原二硫鍵，并采用21.5 mmol/L 碘乙酰胺 (IAA) 溶液進(jìn)行烷基化。在添加 ABC 稀釋尿素溶液至終濃度0.76 mol/L 后，使用 1 µg 測(cè)序級(jí)胰dan白酶（普洛麥格公司）對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行消化（表 1）。

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胰dan白酶將載脂蛋白從精an酸 (R) 和賴氨酸(K) 處裂解，生成選擇用于 Apo A-I 和 B 檢測(cè)的特征肽（表 2）。向每個(gè)樣品中加入已知濃度、由穩(wěn)定同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn) (SIS) 肽（由我們自已合成），以校正樣品檢測(cè)中的任何損失。按照 CLSI C37-A 配制三種確定濃度、基于血清的校準(zhǔn)樣品，用于血清中 ApoA-I 和 Apo B 的直接定量分析。校準(zhǔn)樣品可溯源到 WHO-IFCC 標(biāo)準(zhǔn)。目標(biāo)值為：Apo A-I的濃度為 1.15 g/L、1.60 g/L 和 1.60 g/L（濃度 2 和濃度 3 相同），Apo B 的濃度為 0.76 g/L、0.80 g/L 和 1.29 g/L。

數(shù)據(jù)采集色譜分離在 Agilent 1290 Infinity 液相色譜(UHPLC) 系統(tǒng)上進(jìn)行，采用一個(gè) 15 min 的梯度程序（5% - 95% (v/v) 甲醇/水 + 0.05%(v/v) 甲酸），色譜柱為 ZORBAX StableBond C18 色譜柱 (2.1 mm × 50 mm, 1.8 µm)，流速 0.2 mL/min。采用 Agilent 6490 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。我們建立了一個(gè)動(dòng)態(tài) MRM (dMRM) 方法，用于檢測(cè)所選特征肽保留時(shí)間范圍內(nèi)特定的母離子和子離子（定量離子和定性離子）。除特定的MRM 離子對(duì)外，定量和定性子離子的保留時(shí)間及其比值也被用來確保這些特征肽的特異性檢測(cè)。此外，還使用了觸發(fā)式 MRM(tMRM) 檢測(cè)額外的子離子，用于同合成標(biāo)準(zhǔn)肽的數(shù)據(jù)庫譜圖進(jìn)行比較，比較結(jié)果以匹配分值 (MS) 表示（表 2）。特征肽從相關(guān)文獻(xiàn)2–5 和 Peptide Atlas BestSRM 離子對(duì)列表中選出。實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定相對(duì)于 SIS 肽的內(nèi)源性肽含量并采用基于血清的校準(zhǔn)樣品，利用來自 Apo A-I 和 B 的四種不同特征肽對(duì)血清中的 Apo A-I 和 B 進(jìn)行了定量分析。

方法性能通過長達(dá) 28 h 的胰dan、白酶時(shí)程消化實(shí)驗(yàn)，我們考察了正常和高甘油三酯血癥樣品中胰dan白酶消化的完整度及其肽組成。將不同濃度的 Apo A-I（1.15、1.26、1.38、1.49 和1.60 g/L）和 Apo B（0.76、0.89、1.03、1.16和 1.29 g/L）與濃度 1 和濃度 3 基于血清的校準(zhǔn)樣品混合并分析，評(píng)價(jià)方法的線性和回收率。通過分別重復(fù) 5 次測(cè)定兩個(gè)混合血清 NPS1和 NPS2 中的一個(gè)樣品，對(duì)儀器的變異性進(jìn)行評(píng)估。通過一天內(nèi)獨(dú)立測(cè)定 5 次樣品 (n =5)，以及在 5 天里每天制備并測(cè)定 3 個(gè)樣品(n = 15) 來確定運(yùn)行內(nèi)差異和運(yùn)行間差異。

結(jié)果肽選擇使用文獻(xiàn)中描述的 MRM 轉(zhuǎn)換在正常混合血清消化產(chǎn)物中篩選 Apo A-I 和 B 特征肽。在 15 min 的色譜運(yùn)行（CE 設(shè)置為 20 V 和15 V）中，采用 MRM 模式對(duì)所有離子對(duì)進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，分析樣品。根據(jù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)肽的優(yōu)化結(jié)果，對(duì)于肽 VQPYL 和 DYVSQ (Apo A-I)，以及 VSALL 和 FPEVD (Apo B)，使用 18 V、19 V、24 V 和 20 V 的碰撞電壓值。選擇響應(yīng)強(qiáng)度最高的肽 DYVSQ、VQPYL、AKPAL、QGLLP 和 VSFLS (Apo A-I)，以及FPEVD、TEVIP、TGISP 和 SVSLP（未顯示）(Apo B) 進(jìn)行 Apo A-I 和 B 定量分析的進(jìn)一步評(píng)價(jià)。對(duì)于選中的肽，其最佳碰撞能量通過在 10 - 28 V 的范圍內(nèi)測(cè)定合成肽進(jìn)行確定。dMRM 方法中選擇使定量子離子具有最佳響應(yīng)的碰撞能量（表 2）。

肽生成的完整性正常甘油三酯和高甘油三酯血癥血清樣品(n = 2) 消化產(chǎn)物中肽的生成見圖 2 和 3，并展示了肽 AKPAL、TGISP、QGLLP 和TEVIP 測(cè)定的實(shí)例。高甘油三酯血癥血清中 Apo A-I 和 B 肽的生成動(dòng)力學(xué)與正常甘油三酯血清的類似。在4–8 h 內(nèi)，Apo A-I 的肽 AKPAL、QGLLP和 VSFLS 得到了*消化，而 VQPYL 和DYVSQ 則出現(xiàn)較慢。對(duì)于 Apo B，4 h 內(nèi)即出現(xiàn)肽 SVSLP、TEVIP 和 TGISP 的最大值，而 FPEVD 則需要 20 h。沒有使用 DYVSQ是由于其重現(xiàn)性很差。

線性和回收率Apo A-I 和 B 肽的線性見表 3 和圖 4。Apo A-I 肽的回收率在 92.6% - 103.1% 范圍內(nèi)，而 Apo B 肽的則在 94.4% - 105.6 % 范圍內(nèi)（圖 5）。對(duì)于 Apo A-I 和 B 的 LC/MS/MS 定量分析，在正?；旌涎搴透吒视腿パY樣品的進(jìn)一步分析中，均使用了所有三種濃度的確定濃度的校準(zhǔn)樣品。重現(xiàn)性正?；旌涎?(NPS) 中 Apo A-I 和 B 測(cè)定的重現(xiàn)性見表 4。對(duì)于 NPS 1 和 2，四種 Apo A-I 肽的運(yùn)行間變異系數(shù)在 4.2% 到 8.6 % 之間，四種 Apo B肽的則在 4.2% 到 6.4 % 之間 (n = 15)。Apo A-I 肽 AKPAL，以及 Apo B 肽 TEVIP 和TGISP 具有最小的運(yùn)行間變異系數(shù) (< 5%)。

結(jié)論聯(lián)用 Agilent 1290 Infinity LC 和 Agilent6490 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)，開發(fā)了一個(gè)用于多成分測(cè)定的 LC/MS/MS 方法，實(shí)現(xiàn)了血清 Apo A-I 和 B 的準(zhǔn)確定量分析。開發(fā)了可以同時(shí)測(cè)定血清 Apo A-I 和 B 的樣品制備方案，該方案可以產(chǎn)生正常和高甘油三酯血癥血清中這兩種蛋白的具有相似動(dòng)力學(xué)特性的特征肽，并且僅需使用 5 µL 樣品（該分析混合物中實(shí)際只有 0.5 µL 血清）和 1 µg測(cè)序級(jí)胰dan白酶（酶與蛋白的比例為 1:35）。對(duì)于實(shí)現(xiàn)載脂蛋白準(zhǔn)確而可靠的定量分析，多種肽的細(xì)心選擇至關(guān)重要。使用確定濃度、基質(zhì)匹配的人血清校準(zhǔn)樣品進(jìn)行 Apo A-I 和B 的校準(zhǔn)，這些校準(zhǔn)樣品采用和待測(cè)樣品同樣的樣品制備和測(cè)定程序。運(yùn)行間變異系數(shù)在 5%–10% 范圍內(nèi)，說明方法具有穩(wěn)定的分析性能。我們采用 Agilent 1290 Infinity LC 和 Agilent6490 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)開發(fā)的 ApoA-I 和 B 的研究應(yīng)用方法，具有 Apo A-I 和B 多成分同時(shí)定量分析的潛力。我們還需要對(duì)該應(yīng)用進(jìn)行更進(jìn)一步的分析方法驗(yàn)證，尤其是在高脂血癥血清中，以評(píng)價(jià)其將來在日常臨床化學(xué)中可能的應(yīng)用。