化工儀器網(wǎng)
技術文章
實時熒光定量PCR技術必看干貨小結
閱讀：610 發(fā)布時間：2024-9-2實時熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR)，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。通常我們會重點關注Ct值（Cycle threshold ，Ct），其含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。其原理如下：
1、TaqMan熒光探針：
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成全同步。
2、SYBR熒光染料：
在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加全同步。
熒光染料也稱DNA結合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能與DNA雙鏈的小溝特異性的結合，游離的SYBR Green I幾乎沒有熒光信號，但結合雙鏈DNA后，其熒光信號可呈數(shù)百倍的增加。隨PCR產(chǎn)物的增加，PCR產(chǎn)物與染料的結合量也增大，其熒光信號強度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。
我們將這條熒光擴增曲線人為地分為基線期、指數(shù)擴增期和平臺期三個階段:
1、基線期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所覆蓋，我們無法判斷熒光強度的變化。
2、擴增期，熒光信號呈指數(shù)增長，擴增產(chǎn)物的量與起始模板量存在線性關系，在此階段可定量分析。
3、平臺期，由于底物耗盡等因素.熒光信號不再呈指數(shù)增加。
RT-qPCR原理的三個主要步驟：
1 反轉錄：
使用逆轉錄酶和特定引物將RNA樣品反轉錄成cDNA。
該步驟將RNA模板轉化為更穩(wěn)定且可擴增的DNA形式。
反轉錄過程中使用特定引物。
2 、PCR擴增：
使用特定引物對cDNA進行PCR擴增，這些引物環(huán)繞目標區(qū)域。
PCR是一個循環(huán)過程，呈指數(shù)級擴增DNA模板的數(shù)量。
PCR反應中包含熒光染料或探針，它們結合到擴增的DNA序列上并發(fā)出熒光信號。
3 、熒光實時檢測：
使用實時PCR儀器實時監(jiān)測熒光信號。
熒光的數(shù)量與每個PCR循環(huán)中擴增的DNA數(shù)量成比例。
使用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)以確定循環(huán)閾值（Ct）值，該值表示熒光信號達到特定閾值水平所需的循環(huán)數(shù)。Ct值用于計算原始樣品中存在的目標DNA量，從而允許進行基因表達或病毒載量等定量分析。
實時熒光定量PCR技術中有幾個重要的概念，包括擴增曲線、基線、熒光閾值和域值循環(huán)數(shù)。
1、擴增曲線（amplification curve）:
是在實時熒光定量PCR中監(jiān)測到的熒光信號隨著循環(huán)數(shù)變化而繪制的一條曲線。在進行PCR反應過程中，通過檢測系統(tǒng)對PCR管內的樣品進行實時檢測，最后將熒光信號值通過成像技術顯現(xiàn)在計算機上。正常的擴增曲線包括四個階段：基線期、指數(shù)增長期、線性增長期、平臺期。
2、基線（baseline）：
是背景曲線的一段，在擴增反應的最初數(shù)個循環(huán)里熒光信號變化不大，接近一條直線。
3、熒光閾值（threshold）：
是在熒光擴增曲線指數(shù)增長期設定的一個熒光強度標準(即PCR擴增產(chǎn)物量的標準）。熒光閾值可以設定在PCR擴增的指數(shù)期。
4、閾值循環(huán)數(shù):
表示每個PCR反應管內熒光信號達到設定的熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，即起始拷貝數(shù)越多，CT值越小;起始拷貝數(shù)越少,CT值越大。我們利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可做出以起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標,CT值為縱坐標的一條標準曲線。只要獲得未知模板的CT值,即從標準曲線上計算出該模板的起始拷貝數(shù)。