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凝膠色譜儀的應(yīng)用
閱讀：1675 發(fā)布時(shí)間：2018-12-26
1、分子量的測(cè)定
根據(jù)凝膠色譜的原理，樣品物質(zhì)在凝膠色譜柱中的洗脫性質(zhì)與該物質(zhì)的分子大小有關(guān)。因此選用不同的凝膠色譜柱后，能方便地測(cè)定物質(zhì)的分子量。用此法測(cè)定分子量時(shí)，可以在各種PH值、離子強(qiáng)度和溫度條件下進(jìn)行。所測(cè)定的物質(zhì)可以是天然狀態(tài)，也可以是變性后的。 實(shí)際應(yīng)用中，可先選用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)樣品在同一色譜條件下進(jìn)行色譜分離分析，并以保留體積(或保留時(shí)間)對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)得到一直線(標(biāo)準(zhǔn)曲線)，而后根據(jù)待測(cè)定物在同一條件下的保留體積(或保留時(shí)間)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得/計(jì)算出其分子量。 目前用本法測(cè)定分子量的應(yīng)用范圍非常廣泛。 高分子物質(zhì)的分子量及其分布的測(cè)定：特別是近年來(lái)，隨著各種高分子材料的問(wèn)世，人們對(duì)高分子科學(xué)的不斷探索，高聚物的分子量及其分布的測(cè)定顯得尤為重要，成為科研和生產(chǎn)中*的測(cè)試項(xiàng)目之一。例如：常見(jiàn)的聚苯乙烯塑料制品，其分子量為十幾萬(wàn)，如果聚苯乙烯的分子量低至幾千，就不能成型;相反，當(dāng)分子量大到幾百萬(wàn)，甚至幾千萬(wàn)，它又難以加工，失去了實(shí)用意義?？蒲泻蜕a(chǎn)上通過(guò)控制高聚物的分子量及其分布寬度指數(shù)D(D=Mw/Mn)、分子量微分分布曲線、分子量積分分布曲線來(lái)生產(chǎn)出性能佳的高聚物產(chǎn)品。同樣，除了快速測(cè)定分子量及其分布以外，凝膠滲透色譜還廣泛被用于研究高聚物的支化度，共聚物的組成分布及高聚物中微量添加劑的分析等方面。如果配以在線的分子量檢測(cè)器(如：LALLS、Multi-Angle LS、Dual-Angle LS等)，凝膠滲透色譜可以測(cè)定高聚物的分子量。 蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定：現(xiàn)代蛋白質(zhì)藥物的研究中，凝膠色譜法測(cè)定分子量是蛋白質(zhì)分子量的快速測(cè)定方法之一。一般選用標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)(如：鐵蛋白、醛縮酶、牛血清白蛋白、卵清蛋白、胃蛋白酶、核糖核酸酶，這就是一組分子量從300KD到14KD的標(biāo)準(zhǔn)品)。
2、分離多組分混合物
在一個(gè)多組分混合物中，因各組分的分子量的不同，可以用凝膠色譜法將其各組分分開(kāi)。當(dāng)被分離組分的分子量相距較大時(shí)，如進(jìn)行蛋白質(zhì)和氨基酸，核酸和核苷酸等分離時(shí)，選擇大顆粒、高交聯(lián)度的凝膠。而當(dāng)分離物質(zhì)的分子量差別較小，則選擇一種膠粒能使被分離的組分均包括在該膠粒的分布范圍內(nèi)。
3、脫鹽與分離純化
特別是在生物大分子的分離純化過(guò)程中，經(jīng)常使用鹽進(jìn)行鹽析或洗脫，其高濃度的鹽會(huì)給下一步的純化帶來(lái)不便，因此需將其全部或大部分除去。透析法除鹽不僅耗時(shí)較長(zhǎng)，而且較煩瑣。凝膠色譜脫鹽就是一種簡(jiǎn)單又快速的方法。由于脫鹽是將分子量相距很大的兩類(lèi)物質(zhì)的分開(kāi)，所以一般用于脫鹽的凝膠多為大顆粒、高交聯(lián)度的凝膠。此時(shí)，溶液中大分子(如蛋白質(zhì))的kd=0，鹽類(lèi)的kd=1，易于分離脫鹽。實(shí)際中常用G-25進(jìn)行脫鹽，其效果不僅比透析法快的多，而且比較*，并且回收率高。
4、去熱源
熱源是微生物產(chǎn)生的某些可以使人發(fā)熱的物質(zhì)，多為內(nèi)毒素，是制藥中必須去除的物質(zhì)。內(nèi)毒素是一個(gè)含脂肪A、糖類(lèi)和蛋白，是帶負(fù)電的復(fù)合大分子。內(nèi)毒素經(jīng)常是多聚體，凝膠過(guò)濾層析可有效地將之去除，特別是在小分子藥物。選用的凝膠可以與脫鹽類(lèi)似，只是此時(shí)熱源等大分子物質(zhì)的kd=0，而小分子藥物的kd=1，同樣可以很好而且很方便地去除熱源類(lèi)物質(zhì)。
根據(jù)凝膠色譜的原理，樣品物質(zhì)在凝膠色譜柱中的洗脫性質(zhì)與該物質(zhì)的分子大小有關(guān)。因此選用不同的凝膠色譜柱后，能方便地測(cè)定物質(zhì)的分子量。用此法測(cè)定分子量時(shí)，可以在各種PH值、離子強(qiáng)度和溫度條件下進(jìn)行。所測(cè)定的物質(zhì)可以是天然狀態(tài)，也可以是變性后的。 實(shí)際應(yīng)用中，可先選用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)樣品在同一色譜條件下進(jìn)行色譜分離分析，并以保留體積(或保留時(shí)間)對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)得到一直線(標(biāo)準(zhǔn)曲線)，而后根據(jù)待測(cè)定物在同一條件下的保留體積(或保留時(shí)間)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得/計(jì)算出其分子量。 目前用本法測(cè)定分子量的應(yīng)用范圍非常廣泛。 高分子物質(zhì)的分子量及其分布的測(cè)定：特別是近年來(lái)，隨著各種高分子材料的問(wèn)世，人們對(duì)高分子科學(xué)的不斷探索，高聚物的分子量及其分布的測(cè)定顯得尤為重要，成為科研和生產(chǎn)中*的測(cè)試項(xiàng)目之一。例如：常見(jiàn)的聚苯乙烯塑料制品，其分子量為十幾萬(wàn)，如果聚苯乙烯的分子量低至幾千，就不能成型;相反，當(dāng)分子量大到幾百萬(wàn)，甚至幾千萬(wàn)，它又難以加工，失去了實(shí)用意義?？蒲泻蜕a(chǎn)上通過(guò)控制高聚物的分子量及其分布寬度指數(shù)D(D=Mw/Mn)、分子量微分分布曲線、分子量積分分布曲線來(lái)生產(chǎn)出性能佳的高聚物產(chǎn)品。同樣，除了快速測(cè)定分子量及其分布以外，凝膠滲透色譜還廣泛被用于研究高聚物的支化度，共聚物的組成分布及高聚物中微量添加劑的分析等方面。如果配以在線的分子量檢測(cè)器(如：LALLS、Multi-Angle LS、Dual-Angle LS等)，凝膠滲透色譜可以測(cè)定高聚物的分子量。 蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定：現(xiàn)代蛋白質(zhì)藥物的研究中，凝膠色譜法測(cè)定分子量是蛋白質(zhì)分子量的快速測(cè)定方法之一。一般選用標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)(如：鐵蛋白、醛縮酶、牛血清白蛋白、卵清蛋白、胃蛋白酶、核糖核酸酶，這就是一組分子量從300KD到14KD的標(biāo)準(zhǔn)品)。
2、分離多組分混合物
在一個(gè)多組分混合物中，因各組分的分子量的不同，可以用凝膠色譜法將其各組分分開(kāi)。當(dāng)被分離組分的分子量相距較大時(shí)，如進(jìn)行蛋白質(zhì)和氨基酸，核酸和核苷酸等分離時(shí)，選擇大顆粒、高交聯(lián)度的凝膠。而當(dāng)分離物質(zhì)的分子量差別較小，則選擇一種膠粒能使被分離的組分均包括在該膠粒的分布范圍內(nèi)。
3、脫鹽與分離純化
特別是在生物大分子的分離純化過(guò)程中，經(jīng)常使用鹽進(jìn)行鹽析或洗脫，其高濃度的鹽會(huì)給下一步的純化帶來(lái)不便，因此需將其全部或大部分除去。透析法除鹽不僅耗時(shí)較長(zhǎng)，而且較煩瑣。凝膠色譜脫鹽就是一種簡(jiǎn)單又快速的方法。由于脫鹽是將分子量相距很大的兩類(lèi)物質(zhì)的分開(kāi)，所以一般用于脫鹽的凝膠多為大顆粒、高交聯(lián)度的凝膠。此時(shí)，溶液中大分子(如蛋白質(zhì))的kd=0，鹽類(lèi)的kd=1，易于分離脫鹽。實(shí)際中常用G-25進(jìn)行脫鹽，其效果不僅比透析法快的多，而且比較*，并且回收率高。
4、去熱源
熱源是微生物產(chǎn)生的某些可以使人發(fā)熱的物質(zhì)，多為內(nèi)毒素，是制藥中必須去除的物質(zhì)。內(nèi)毒素是一個(gè)含脂肪A、糖類(lèi)和蛋白，是帶負(fù)電的復(fù)合大分子。內(nèi)毒素經(jīng)常是多聚體，凝膠過(guò)濾層析可有效地將之去除，特別是在小分子藥物。選用的凝膠可以與脫鹽類(lèi)似，只是此時(shí)熱源等大分子物質(zhì)的kd=0，而小分子藥物的kd=1，同樣可以很好而且很方便地去除熱源類(lèi)物質(zhì)。