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　　本生帶您了解：ELISA實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)問(wèn)題和注意事項(xiàng)

　　用于ELISA測(cè)定的臨床標(biāo)本最為常用的是血清(漿)。本實(shí)驗(yàn)室用ELISA測(cè)定乙肝兩對(duì)半，甲肝，戊肝，抗HIV的標(biāo)本時(shí)，在處理和保存方面要考慮以下幾個(gè)方面：

　　1)要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血及血清中混有紅細(xì)胞。當(dāng)標(biāo)本出現(xiàn)嚴(yán)重溶血及血清中混有紅細(xì)胞時(shí)，反應(yīng)孔不易洗凈，殘留在反應(yīng)孔內(nèi)的血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶的活性，顯色時(shí)可能造成假陽(yáng)性。

　　2)標(biāo)本凝固不全強(qiáng)行離心，造成血清中含有少量的纖維蛋白原，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中形成纖維蛋白吸附在反應(yīng)孔孔壁上不易洗掉，易造成假性結(jié)果。

　　3)血清標(biāo)本可在2～8℃下保存1周。如血清樣本需長(zhǎng)時(shí)間保存，則需放入-20℃冰柜內(nèi)冰凍保存。冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免反復(fù)凍融，標(biāo)本可能引起假陰性結(jié)果。此外凍融標(biāo)本的混勻不要進(jìn)行劇烈振蕩，應(yīng)反復(fù)顛倒混勻。

　　ELISA測(cè)定中試劑準(zhǔn)備

　　在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái)，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測(cè)定，證試劑盒溫度要和室溫一致。如果把試劑盒從冰箱拿出來(lái)直接做實(shí)驗(yàn)會(huì)造成一些弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。因?yàn)樵诤竺娴姆跤磻?yīng)步驟中，造成孵育時(shí)間不夠。其次，ELISA實(shí)驗(yàn)中洗板用的洗液需每日更換配制，稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。

　　加血清樣本及反應(yīng)試劑

　　血清樣本使用微量加樣槍加樣。使用微量加樣槍加樣必須注意避免以下幾點(diǎn)：

　　1)加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。需勻速加樣，吸樣時(shí)，加樣槍需按到第一檔，加樣時(shí)，加樣槍需直接按到底。

　　2)加樣應(yīng)直接加入反應(yīng)孔底部，加在反應(yīng)孔孔壁上易濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。盡量避免出現(xiàn)氣泡。

　　3)反應(yīng)試劑的加入時(shí)先要注意試劑的有效期，再注意滴加的角度和滴加的速度。滴加太快易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間。

　　溫育的時(shí)間與溫度

　　溫育是ELISA測(cè)定中最容易出現(xiàn)問(wèn)題的步驟。溫育溫度應(yīng)在37℃，水浴。溫育時(shí)間應(yīng)按照試劑說(shuō)明書上的時(shí)間嚴(yán)格執(zhí)行。溫育實(shí)際測(cè)定操作中要注意以下幾點(diǎn)：

　　1)要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時(shí)間。溫育時(shí)間不夠，弱陽(yáng)性樣本測(cè)不出來(lái)。

　　2)因?yàn)椴捎盟。栽跍赜龝r(shí)一定要封板，防止水蒸氣形成水滴掉入反應(yīng)孔內(nèi)造成污染，并有可能整板花板。

　　ELISA測(cè)定的洗板

　　全自動(dòng)洗板機(jī)的使用應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

　　1)洗板前，應(yīng)檢查洗液瓶、蒸餾水瓶是否充足，廢液瓶是否滿瓶

　　2)在自檢過(guò)程中注意觀察洗液灌注是否通暢，排液是否通暢。

　　3)在洗板過(guò)程中，應(yīng)注意觀察反應(yīng)孔每孔是否灌滿且無(wú)外溢，每孔吸水是否吸盡，并且要保證洗液在孔中放置的時(shí)間。

　　ELISA測(cè)定以TMB為底物的顯色

　　加入底物開(kāi)始顯色反應(yīng)前，最好是先檢查一下底物溶液的有效期。滴入A、B顯色劑后，需溫育15min，最后加入終止液終止反應(yīng)，振蕩混勻后即可進(jìn)行下面的比色測(cè)定判斷結(jié)果。在此過(guò)程中應(yīng)注意不要把顯色劑和終止液滴入順序弄反，否則重做實(shí)驗(yàn)。

　　ELISA的比色測(cè)定

　　ELISA的比色測(cè)定由酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，故需強(qiáng)調(diào)比色測(cè)定時(shí)，一定要注意酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)是否是雙波長(zhǎng)(450nm和630nm)。

　　ELISA測(cè)定結(jié)果判定

　　結(jié)果判定一般是根據(jù)比色結(jié)果和肉眼觀察綜合判定。如在判定過(guò)程發(fā)現(xiàn)有些反應(yīng)孔出現(xiàn)倒陰不陽(yáng)的現(xiàn)象或出現(xiàn)不常見(jiàn)的模式(如乙肝兩對(duì)半中出現(xiàn)12陽(yáng)性等)，需本著嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度，重新復(fù)查。

　　對(duì)ELISA測(cè)定中出現(xiàn)問(wèn)題的可能原因(非試劑盒本身的原因)，總結(jié)如下：

　　1)弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本檢測(cè)不出溫育的時(shí)間或溫度不夠;顯色反應(yīng)時(shí)間太短;所用配制緩沖液的蒸餾水有問(wèn)題。

　　2)測(cè)定的重復(fù)性差，這是由于測(cè)定操作引起的問(wèn)題，包括

　　①加樣本及試劑量不準(zhǔn);孔間不一致

　?、诩訕舆^(guò)快，孔間發(fā)生污染

　　③加錯(cuò)樣本

　?、芗訕颖炯霸噭r(shí)，加在孔壁

　?、莶煌?hào)試劑盒中組分混用

　　⑥溫育時(shí)間、洗板、顯色時(shí)間不一致

　　⑦孔內(nèi)污染雜物，

　　血清標(biāo)本未凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細(xì)胞，易出現(xiàn)假陽(yáng)性等。

　　3)全部孔都不顯色

　?、俾┘用附Y(jié)合物;

　　②洗板液配制中出現(xiàn)問(wèn)題

　?、勐┘语@色劑A或B

　?、芙K止劑當(dāng)顯色劑使用

　　4)全部板孔均有顯色

　?、侔宀桓蓛?/p>

　?、陲@色液變質(zhì)

　?、巯窗逡菏苊傅任廴?/p>