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　　實(shí)時熒光定量PCR儀指的是在PCR進(jìn)行的同時，對其過程進(jìn)行監(jiān)測的能力（即實(shí)時）。因此，數(shù)據(jù)可在PCR擴(kuò)增過程中，而非PCR結(jié)束之后，進(jìn)行收集。這為基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來了革命性的變革。在實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)中，反應(yīng)以循環(huán)中檢測到目標(biāo)擴(kuò)增的時間點(diǎn)為特征，而非在一定循環(huán)數(shù)后目標(biāo)分子累計(jì)的擴(kuò)增量。目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越高，則會越快觀察到熒光的顯著增加。相反，終點(diǎn)法檢測（也稱“讀板檢測”）測量的是PCR循環(huán)結(jié)束時累計(jì)的PCR產(chǎn)物量。

 

　　實(shí)時熒光定量PCR儀注意事項(xiàng)：

　　1.在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA斷裂。

　　2.為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對照。

　　3.內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。

　　4.PCR不能進(jìn)入平臺期，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定。

　　5.防止DNA的污染：采用DNA酶處理RNA樣品，在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。

　　6.所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。

　　7.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。

　　8.有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。