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活性氧(ROS)檢測---熒光探針法
閱讀:74 發(fā)布時間:2025-6-3原理:
熒光探針法通過使用能夠穿透細胞膜的熒光探針來實現(xiàn)ROS檢測。以DCFH-DA為例,該物質(zhì)本身呈非極性,可自由穿過細胞膜進入細胞內(nèi)部。進入細胞后,細胞內(nèi)的酯酶會將DCFH-DA水解,脫去乙?;蒁CFH。由于DCFH具有極性,無法自由跨膜,因而只能留在細胞內(nèi)。當細胞內(nèi)存在ROS時,DCFH會被ROS氧化,生成具有強熒光特性的DCF。DCF的熒光強度與細胞內(nèi)ROS的水平呈正相關(guān),通過檢測DCF的熒光強度,可以間接反映細胞內(nèi)ROS的含量。

操作流程:
樣本準備:對于細胞樣本,需在適宜的培養(yǎng)條件下將細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期;對于組織樣本,則需先將組織剪碎,進行勻漿處理,隨后通過離心去除雜質(zhì),取上清液備用。
探針負載:將 DCFH-DA 探針用適宜的緩沖液稀釋至適當濃度,加入至細胞懸液或組織樣本中,置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育 20-30 分鐘,以確保探針充分進入細胞并被水解。
清洗樣本:使用緩沖液多次洗滌細胞或樣本,以去除未進入細胞的 DCFH-DA 探針,防止其對后續(xù)檢測造成干擾。
檢測熒光:將處理完畢的樣本置于熒光顯微鏡下,觀察細胞內(nèi)熒光分布情況,或利用流式細胞儀測定樣本的熒光強度。若采用熒光顯微鏡,可通過拍照記錄不同視野下細胞的熒光圖像;若使用流式細胞儀,則需先對儀器進行校準,設(shè)定適宜的檢測參數(shù),如激發(fā)光波長、發(fā)射光波長等,隨后將樣本上機檢測。
優(yōu)缺點:
優(yōu)點:
靈敏度高,能夠精準檢測細胞內(nèi)低水平的 ROS 變化。
特異性顯著,通過選擇不同的熒光探針,可精確檢測特定種類的 ROS。
具備細胞水平定位檢測功能,直觀展現(xiàn) ROS 在細胞內(nèi)的分布狀況。
廣泛適用于多種樣本類型,涵蓋細胞、組織、微生物等。
缺點:
熒光探針價格相對昂貴,顯著增加實驗成本。
熒光信號易受細胞內(nèi)其他物質(zhì)干擾,例如細胞內(nèi)的還原劑可能還原 DCF,導(dǎo)致熒光強度下降,影響檢測結(jié)果準確性。
探針穩(wěn)定性不足,需避光保存且現(xiàn)用現(xiàn)配,對實驗操作要求較高。