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技術(shù)文章

活性氧(ROS)檢測---熒光探針法

閱讀:76          發(fā)布時(shí)間:2025-6-3

原理:

熒光探針法通過使用能夠穿透細(xì)胞膜的熒光探針來實(shí)現(xiàn)ROS檢測。以DCFH-DA為例,該物質(zhì)本身呈非極性,可自由穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。進(jìn)入細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)的酯酶會(huì)將DCFH-DA水解,脫去乙?;蒁CFH。由于DCFH具有極性,無法自由跨膜,因而只能留在細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在ROS時(shí),DCFH會(huì)被ROS氧化,生成具有強(qiáng)熒光特性的DCF。DCF的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS的水平呈正相關(guān),通過檢測DCF的熒光強(qiáng)度,可以間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。



操作流程:

  1. 樣本準(zhǔn)備:對于細(xì)胞樣本,需在適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期;對于組織樣本,則需先將組織剪碎,進(jìn)行勻漿處理,隨后通過離心去除雜質(zhì),取上清液備用。

  2. 探針負(fù)載:將 DCFH-DA 探針用適宜的緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度,加入至細(xì)胞懸液或組織樣本中,置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育 20-30 分鐘,以確保探針充分進(jìn)入細(xì)胞并被水解。

  3. 清洗樣本:使用緩沖液多次洗滌細(xì)胞或樣本,以去除未進(jìn)入細(xì)胞的 DCFH-DA 探針,防止其對后續(xù)檢測造成干擾。

  4. 檢測熒光:將處理完畢的樣本置于熒光顯微鏡下,觀察細(xì)胞內(nèi)熒光分布情況,或利用流式細(xì)胞儀測定樣本的熒光強(qiáng)度。若采用熒光顯微鏡,可通過拍照記錄不同視野下細(xì)胞的熒光圖像;若使用流式細(xì)胞儀,則需先對儀器進(jìn)行校準(zhǔn),設(shè)定適宜的檢測參數(shù),如激發(fā)光波長、發(fā)射光波長等,隨后將樣本上機(jī)檢測。

優(yōu)缺點(diǎn):

優(yōu)點(diǎn):

  1. 靈敏度高,能夠精準(zhǔn)檢測細(xì)胞內(nèi)低水平的 ROS 變化。

  2. 特異性顯著,通過選擇不同的熒光探針,可精確檢測特定種類的 ROS。

  3. 具備細(xì)胞水平定位檢測功能,直觀展現(xiàn) ROS 在細(xì)胞內(nèi)的分布狀況。

  4. 廣泛適用于多種樣本類型,涵蓋細(xì)胞、組織、微生物等。

缺點(diǎn):

  1. 熒光探針價(jià)格相對昂貴,顯著增加實(shí)驗(yàn)成本。

  2. 熒光信號易受細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)干擾,例如細(xì)胞內(nèi)的還原劑可能還原 DCF,導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降,影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。

  3. 探針穩(wěn)定性不足,需避光保存且現(xiàn)用現(xiàn)配,對實(shí)驗(yàn)操作要求較高。


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