国产精品视频一区二区三区四,亚洲av美洲av综合av,99国内精品久久久久久久,欧美电影一区二区三区电影

一、 實驗儀器與試劑

 表格一：實驗儀器

儀器名稱	型號	生產廠家
低溫高速離心機	64R	BECKMAN
PCR 儀	9700	ABI
熒光定量 PCR 儀	7500	ABI

 

儀器	廠家	型號
小型垂直電泳槽	Biorad	164-8001
轉印槽	Biorad	Trans-Blot
脫色搖床	常州澳華	TY-80B
電泳儀	上海天能	EPS-200
低溫高速離心機	64R	BECKMAN
酶標儀	Thermo	Thermo Scientific Microplate Reader

 表格二：試劑

試劑名稱	廠家
PBS (0.01M, pH 7.4)	自配
Trizol	Life Technologies
Lv仿	國藥集團
異丙醇	國藥集團
乙醇	國藥集團
PrimeScript® RT reagent Kit	Takara
熒光定量試劑盒	Takara

 

二、 實驗步驟

1、樣本處理

4℃ 12000rpm 離心收集細胞，棄上清。PBS 清洗 1 遍后，加入 1mL Trizol 充分混勻。

2、兩相分離 每個樣品中加入 0.2 mL 的lv仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩管體，室溫靜置 5min。4℃下 12000rpm

離心 15 min。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lv仿相，中間層和上層的無色的水相。RNA 全部被分配于水相中。水相的體積大約是勻漿時加入的 Trizol 試劑的 60%。

3、RNA 沉淀 將水相轉移到新離心管中。加入等體積的異丙醇，水相與異丙醇混合以沉淀其中的 RNA?；靹虿⒃谑覝胤跤?10 min 后，4℃ 12000rpm 離心 10 min。

4、RNA 清洗 移去上清液，加入 1 mL 75%乙醇，清洗 RNA 沉淀。振蕩后，4℃ 7500 rpm 離心5 min。

5、重新溶解 RNA 沉淀

去除乙醇溶液，空氣中干燥 RNA 沉淀 5-10 min。溶解 RNA 時，先加入無 RNA 酶的水用槍反

復吹打幾次，然后 55 到 60℃孵育 10 min。獲得的 RNA 溶液保存于- 70℃。

6、反轉錄

1) 按下列組份配制 RT 反應液

5×PrimeScript Buffer	5 μL
PrimeScript® RT Enzyme Mix I	1 μL
Oligo dT Primer(50 μM)×1	1 μL
Random 6 mers(100 μM)×1	1.5 μL
Total RNA	1 ng
RNase Free ddH2O	Up to 25 μL

2）反轉錄反應條件如下: 37℃ 15min，85℃ 5s。

3）反應結束后，將其放在冰上待用或-20℃保存。

7、熒光定量 PCR

引物設計

Gene	Forward Primer	Reverse Primer
β-action	5′-TTCCAGCCCTCCTTCCTG-3′	5′-GCCCGACTCGTCATACTCC-3′
BCL	5′ -CTACCGTCGTGACTTCGC -3	3′-CCTATTGCCTCCGACCCT-5′

 

 

按下列組份配制 Realtime PCR 反應體系

 

SYBR Premix Ex Taq	10 μL
PCR Forward Primer(10μM)	1 μL
PCR Reverse Primer(10μM)	1 μL
cDNA 模板	1 μL
ddH2O	7 μL
Total	Up to 20 μL

 

用漩渦振蕩器將管中溶液*混合均勻，短暫低速離心。

3）點樣。將混合好的液體加入孔板中，每個樣本的每個基因保證3個復孔,點完樣之后將 PCR 板置于離心機中 2000rpm、2min，然后用錫箔紙將板包好，置于 4 度冰箱中備用。 4） PCR 反應

Real time PCR 儀使用 ABI7500,PCR 程序已優(yōu)化 將步驟 3 中已點好樣的 PCR 板置于 Realtime PCR 儀上進行 PCR 反應：首先是預變形：95℃/10min

第二步是循環(huán)反應 40 cycles : 95℃/15s; 60℃/45s(收集熒光) ;72℃/45s 第三步溶解曲線：95℃/15s; 60℃/1min ;95℃/15s

 

三、 結果與計算（采用 2 - △△ CT 法進行分析）

基因相對表達量

創(chuàng)凌生物為您提供優(yōu)質的服務！