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雙熒光素酶檢測報告實驗步驟及原理

一、實驗原理

利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特點，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（firefly luciferase）的上游，構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷性刺前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響。

同時，為了減少內(nèi)在的變化因素對實驗準(zhǔn)確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinilla luciferase)的質(zhì)粒作為對照質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照，使測試結(jié)果不受實驗條件變化的干擾。

二、實驗材料

1. 實驗器材

名稱	廠家	型號
離心機	Thermo	MICROCL 17
水浴鍋	北京君意東方設(shè)備有限公司	JY300
紫外分析儀	北京君意東方設(shè)備有限公司	JY02S
GloMax發(fā)光檢測儀	Promega	96孔
分光光度計	上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司	752
二氧化碳培養(yǎng)箱	Thermo	3111
旋渦震蕩儀	其林貝爾	QL-861
微量移液器	德國Eppendorf公司	\
Aquapro超級純水儀	艾科浦	AJY -0501
生物安全柜	蘇凈安泰	BS-1300IIA2
倒置熒光顯微鏡	OLYMPUS	CKX41

2. 試驗主要試劑

名稱	廠家	貨號
Dual-Luciferase® Reporter Assay System	Promega	E1910
24孔板	Corning	3599
DMEM 培養(yǎng)基	Gibco	11995065
胎牛血清FBS	Gibco	10099141
胰酶	Gibco	25200-056
磷酸鹽緩沖液	Gibco	10010023
青霉素-鏈霉素	Gibco	15140122

 

三、實驗操作步驟：

DLA檢測

1. 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞傳代

1. 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，評估細(xì)胞匯合的程度以及確認(rèn)無細(xì)菌和真菌污染；
2. 移去培養(yǎng)皿（瓶）中的培養(yǎng)液；
3. 加入相當(dāng)于培養(yǎng)液體積一半的PBS清洗單層細(xì)胞，一般三次即可；
4. 按1ml/25cm2表面積的量加入0.25%胰酶消化單層細(xì)胞。搖晃培養(yǎng)皿（瓶）使其胰蛋白酶覆蓋細(xì)胞單層，倒出多余的胰蛋白酶；
5. 將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱，放置2-10 min;
6. 用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞以確保所有細(xì)胞都分離且漂浮，輕拍培養(yǎng)皿（瓶）的一側(cè)來釋放殘留的貼壁細(xì)胞；
7. 用少量的含新鮮血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞以滅活胰蛋白酶，取出100-200μl用于計數(shù)；
8. 將所需數(shù)量的細(xì)胞移至一個新標(biāo)記好的溫育過培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿（瓶）中；選擇適當(dāng)培養(yǎng)條件培養(yǎng)細(xì)胞系；
9. 按照細(xì)胞系的生長特性重復(fù)該步驟，知道細(xì)胞狀態(tài)良好、無污染，可以鋪板使用，其余選擇凍存。

1. 活細(xì)胞計數(shù)

1. 取一瓶傳代的細(xì)胞，待長成單層以后使用；細(xì)胞懸液的制備方法：用0.25%的胰酶消化、PBS洗滌后，加入培養(yǎng)液吹打制成待測細(xì)胞懸液。
2. 蓋好蓋玻片，取一套血球計數(shù)槽，制備計數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸適量細(xì)胞懸液到離心管中，加入等體積臺盼藍(lán)染液，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。若僅是單純的進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，不考慮細(xì)胞的活力，則可不使用臺盼藍(lán)染色。
3. 將細(xì)胞懸液滴入計數(shù)板，注意蓋玻片下不要有氣泡，也不要懸液流入旁邊槽中。
4. 統(tǒng)計四個大格的細(xì)胞數(shù)，將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四角的大格（每格含有16個中格）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。
5. 計算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)。按照下面公式計算細(xì)胞密度：
6. （細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml = (四個大格子細(xì)胞數(shù)/4）×2×10⁴

1. Dual-Luciferase® Reporter Assay試劑盒檢測步驟

1. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：按照上述實驗分組的情況，采用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑盒的方法進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染12小時后更換新鮮培養(yǎng)基；
2. 樣品裂解：轉(zhuǎn)染72小時后PBS清洗細(xì)胞兩次，每孔加入250ul 1×PLB裂解液，搖床上裂解細(xì)胞；
3. 樣品檢測：在96孔黑色板中加入100ul的LAR II試劑，后加入20ul的裂解液后檢測讀數(shù)；
4. 內(nèi)參檢測：10s內(nèi)加入100ul的Stop & Glo底物，檢測讀數(shù)；
5. 結(jié)果分析：導(dǎo)出數(shù)據(jù)后采用GraphPad prism 5軟件進(jìn)行結(jié)果分析并制圖；