在過去的數(shù)年間，二代測(cè)序（ NGS ）在幾乎所有的遺傳研究和診斷領(lǐng)域都發(fā)展為了一個(gè)強(qiáng)大的工具。而任何 NGS 實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵是初始 RNA 和 DNA 樣本以及它們所生成的文庫的質(zhì)量控制（QC）。
二代測(cè)序(NGS)的建庫流程是很長很復(fù)雜的，建庫的每一步都建立在前一步的基礎(chǔ)上，因而質(zhì)量控制（QC）顯得尤為重要。無論您的初始樣本類型是什么，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中，確保靶標(biāo)的完整性、大小和集中程度是構(gòu)建高質(zhì)量文庫，進(jìn)而獲得準(zhǔn)確、可重復(fù)的結(jié)果的關(guān)鍵。為了幫助您更好地確定實(shí)驗(yàn)流程，安捷倫匯總了各類初始樣本的各種建庫流程。
理想的 NGS 質(zhì) 控步驟應(yīng)易于操作、經(jīng)濟(jì)，并且對(duì)于濃度非常低的樣品也能提供快速且無爭(zhēng)議的結(jié)果。本質(zhì)控方法是運(yùn)用瓊脂糖電泳法來判斷樣本的大小與完整性，該方 法成本低，但有種種局限性，具體就不在此贅述。確保樣品“滿足目標(biāo)用途”的另一種方法是應(yīng)用自動(dòng)化的電泳分離，并進(jìn)行熒光檢測(cè)和自動(dòng)數(shù)據(jù)分析。
測(cè)序過程中的關(guān)鍵 QC 步驟
Fragmentation
片段化是將樣本剪切成更小的片段的過程?？梢酝ㄟ^酶切或超聲的方法來實(shí)現(xiàn)。QC 是這里的一個(gè)重要步驟，以確保片段化的條件是合適的。
Ligate adaptors
接頭是已知的寡核苷酸序列，用于連接到未知的目標(biāo)測(cè)序片段，提供測(cè)序引物結(jié)合區(qū)和樣本識(shí)別碼。接頭連接后的 QC 可以確保接頭成功連接到 DNA。
Size selection
片段篩選的目的是去掉多余的引物和接頭序列，獲得需要的目標(biāo)序列。QC 在這一步是至關(guān)重要的，可以確保后留下的是目標(biāo)大小和足夠濃度的文庫。
Normalize/pool
在文庫制備結(jié)束時(shí)，必須對(duì)樣本進(jìn)行量化，以確定要加載到測(cè)序儀上的文庫量。如果需要多個(gè)文庫混合上機(jī)測(cè)序，QC 可以幫助提供稀釋指導(dǎo)，確保加載到測(cè)序儀上的文庫是均勻的，有利于提高數(shù)據(jù)的均一性。
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