成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)指南

成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)是骨生物學(xué)研究的重要技術(shù)，主要來(lái)源包括骨組織、骨膜、骨髓等。以下是幾種常用的實(shí)驗(yàn)方法：

一、骨組織塊培養(yǎng)法

1. ?取材?：使用新生動(dòng)物顱骨或手術(shù)切除的人骨組織，去除骨膜及結(jié)締組織

2. ?處理?：將骨組織弄成1-2mm2大小的碎片

3. ?培養(yǎng)?：

• 將骨片直接接種于培養(yǎng)瓶

• 反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使植塊面朝上，加入少量培養(yǎng)液

• 2小時(shí)后翻轉(zhuǎn)使組織塊浸沒(méi)

二、酶消化法

顱骨消化法（適用于新生小鼠/大鼠）

1. 取出生后1-7天小鼠顱骨，75%酒精消毒

2. 用0.25%?trypsase預(yù)消化15分鐘去除成纖維細(xì)胞

3. 0.1%Ⅱ型膠原酶消化20分鐘（37℃）

4. 離心收集細(xì)胞，用含20%胎牛血清的F12培養(yǎng)液懸浮

改良消化法

• 可進(jìn)行多輪消化提高細(xì)胞產(chǎn)量

• 消化后骨片呈黏稠狀時(shí)可均勻鋪于培養(yǎng)瓶下層

三、骨膜來(lái)源培養(yǎng)

1. 取手術(shù)切除的骨膜，去除結(jié)締組織

2. 碎后用0.25%?trypsase+EDTA混合液消化20-30分鐘

3. Ⅰ型膠原酶二次消化90分鐘

4. 調(diào)整細(xì)胞密度至1×10?-5×10?個(gè)/ml接種

培養(yǎng)條件

• ?培養(yǎng)基?：常用F12或RPMI 1640，添加12-15%胎牛血清

• ?環(huán)境?：37℃、5% CO?、飽和濕度

• ?換液?：24小時(shí)后換液，之后每48-72小時(shí)更換

注意事項(xiàng)

1. 原代細(xì)胞一般7天長(zhǎng)滿(mǎn)，傳代使用0.25%?trypsase消化3-5分鐘

2. 建議使用2-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，避免細(xì)胞老化

3. 骨膜來(lái)源細(xì)胞具有成骨和成肌腱的雙向分化潛能

4. 機(jī)械敏感蛋白PIEZO1影響細(xì)胞分化方向

不同來(lái)源的成骨細(xì)胞培養(yǎng)條件略有差異，建議根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適方法