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細(xì)胞免疫熒光步驟

閱讀：1125        發(fā)布時(shí)間：2021-4-25

細(xì)胞免疫熒光步驟

 

實(shí)驗(yàn)方法原理

在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中，需要用到細(xì)胞爬片，通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，細(xì)胞在爬片上生長，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光。
實(shí)驗(yàn)材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞爬片免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟

第一天：

1. 在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；

2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；

3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室溫通透20min（細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟）；

4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min；

5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；

第二天：

6. 加熒光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行。

7. 復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5minx4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
注意事項(xiàng)

1.取細(xì)胞爬片時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。

 

2.種細(xì)胞過程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細(xì)胞局部生長過密。

 

 

 

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