產(chǎn)品分類 品牌分類

流式細胞儀工作原理

閱讀：2344 發(fā)布時間：2021-7-9

流式細胞儀工作原理

流式細胞術(shù)是一種細胞分析技術(shù)，它在20世紀50年代被用于測量細胞體積，可在細胞隨快速流動的流體直線通過觀察孔時進行檢測。從那時起，許多工程師和研究人員不斷創(chuàng)新，最終帶來了現(xiàn)代流式細胞儀。在流式細胞儀中，溶液中的細胞以每秒10,000個細胞（或更多）的速度通過儀器的激光束，進而對細胞進行檢測。如今的流式細胞儀具有更多的可檢測熒光參數(shù)（從1或2至最多30個左右或更多），可同時測量同一個細胞上的所有這些參數(shù)。流式細胞術(shù)速度快且具有單細胞水平檢測能力，可為細胞生物學(xué)家提供統(tǒng)計學(xué)功能，能夠快速分析和表征數(shù)百萬個細胞，但無法獲得顯微鏡可提供的形態(tài)特征和亞細胞定位?？茖W(xué)，就像生活一樣，一切都在于權(quán)衡取舍！請參見表1流式細胞術(shù)和顯微鏡技術(shù)的對比。

表 1.流式細胞術(shù)和熒光顯微成像作為細胞分析技術(shù)的對比。

	流式細胞術(shù)	顯微鏡成像	注釋
總體情況
儀器/軟件復(fù)雜性和費用	+++	+++	流式細胞術(shù)：需要的參數(shù)越多，儀器/分析軟件越復(fù)雜、越昂貴顯微鏡成像：相對便宜，但是實驗越復(fù)雜，儀器和分析軟件就可能越昂貴
單細胞檢測參數(shù)數(shù)量	+++	+	流式細胞術(shù)：最多30個參數(shù) 顯微鏡成像：特殊儀器最多6個參數(shù)
定量分析	+++	++	流式細胞術(shù)：利用內(nèi)置軟件可輕松進行統(tǒng)計顯微鏡成像：可利用儀器和軟件進行定量，或者有時也可以手動定量，但很耗時
靈敏度	+++	+++	流式細胞術(shù)：取決于熒光染料、實驗設(shè)計和儀器顯微鏡成像：取決于熒光染料和曝光時間
通量	+++	++	流式細胞術(shù)：可在短時間內(nèi)檢測數(shù)百萬細胞顯微鏡成像：需要使用特殊成像儀器實現(xiàn)高通量
樣品類型
固定細胞	+++*	+++	兩種技術(shù)均可
活細胞	+++	+++	兩種技術(shù)均可
組織	+	+++	流式細胞術(shù)：需要解離組織顯微鏡成像：可能需要組織切片，但可檢測到原位特征
研究應(yīng)用
細胞分選	+++	-	流式細胞術(shù)：利用專業(yè)分選儀，對用戶定義的細胞群進行物理分離和收集顯微鏡成像：不可能實現(xiàn)
動態(tài)/延時數(shù)據(jù)	+	++	流式細胞術(shù)：可能，但困難顯微鏡成像：常規(guī)實驗
罕見細胞檢測	+++	+	流式細胞術(shù)：易于完成顯微鏡成像：在無軟件或儀器的情況下進行檢測，很耗時
RNA	++	++	流式細胞術(shù)：利用特殊檢測可以實現(xiàn)，即在同一檢測中結(jié)合蛋白質(zhì)和RNA檢測顯微成像：易于可視化，新型檢測可開發(fā)多參數(shù)分析
結(jié)果/形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)	+	+++	流式細胞術(shù)：可使用成像細胞儀，它結(jié)合了流式細胞術(shù)和成像技術(shù) 顯微鏡成像：該技術(shù)的主要優(yōu)勢
* 假設(shè)試劑尚未在固定細胞上進行驗證。

流式細胞術(shù)的潛在應(yīng)用

流式細胞術(shù)的潛在應(yīng)用非常多，包括檢測和測量：

蛋白質(zhì)表達 - 遍及所有細胞，包括細胞核內(nèi)
蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯后修飾 - 包括剪切和磷酸化蛋白質(zhì)
RNA - 包括IncRNA、 miRNA和mRNA轉(zhuǎn)錄物
細胞健康狀態(tài) - 從存活率到晚期凋亡或程序化細胞死亡
細胞周期狀態(tài) - 是評估細胞處于G0/G1期、S期、G2期或多倍體狀態(tài)的強大工具，包括分析細胞凋亡和活化
鑒定和表征異質(zhì)樣本中的不同細胞亞群 - 包括區(qū)分中樞效應(yīng)記憶細胞和耗竭T細胞或調(diào)節(jié)性T細胞

分選用流式細胞儀還可以分選細胞并回收細胞亞群以用于后續(xù)實驗。這種專業(yè)流式細胞儀又被稱為熒光激活細胞分選儀（FACS），這一術(shù)語有時會與“流式細胞儀”混淆。然而，這種用法是錯誤的。流式細胞儀是不能進行細胞分選的分析儀器。細胞分選儀利用與流式細胞儀相似的流體學(xué)和熒光成分，但是能夠?qū)愘|(zhì)樣品中的特定細胞群體轉(zhuǎn)移到獨立試管中，這通常是基于特定的熒光標記特性。如果是在無菌條件下進行收集，則這些細胞可用于進一步的培養(yǎng)、操作和研究。

流式細胞術(shù)工作原理概述

流式細胞儀的三個主要元件是流體學(xué)、光學(xué)和電子學(xué)系統(tǒng)（圖1）。

流式細胞儀的流體系統(tǒng)負責將樣品從樣品管轉(zhuǎn)移到流動池。一旦通過流動池（并通過激光束），樣品將被分選出來（在細胞分選儀中）或移到廢液中。
光學(xué)系統(tǒng)的元件包括激發(fā)光源、透鏡和濾光片（用于收集和移動儀器周圍的光）以及用于產(chǎn)生光電流的檢測系統(tǒng)。
電子系統(tǒng)是流式細胞儀的大腦。在這里，來自檢測器的光電流經(jīng)過數(shù)字化、處理和保存，以用于后續(xù)分析。

圖 1.流式細胞儀三大主要元件示意圖。

樣品上樣到儀器

典型的實驗從單細胞懸浮液中的熒光標記細胞開始，但是可以使用任何顆粒類型的樣品。將樣品置于流式細胞儀上，樣品被吸到儀器中，細胞懸浮在一種被稱為鞘液的生理緩沖液。流體系統(tǒng)（管道、泵和閥）將初始樣品懸浮液排列成單列細胞流（圖2），并使細胞通過流式細胞儀以進行分析。

圖 2.流式細胞儀的流體學(xué)。流動池（也稱為流式小室）使樣品中的細胞（顆粒）排成一列。這是單細胞分析的關(guān)鍵步驟。

激光檢測點

細胞與激光發(fā)生相互作用的地方稱為激光檢測點（圖3）。您也可能聽過它的另一個名字“激光攔截”。這是熒光檢測發(fā)生的地方。當激光束照射到單個細胞時，一些光會撞到細胞內(nèi)的物理結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致光線散射。這種光散射可被測量，并且與相對細胞大小和細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)相關(guān)。這些測量稱為前向角散射（FSC）和側(cè)角散射（SSC），取決于收集光的位置相對于激光路徑的角度。幾乎同時，來自激光器的光激發(fā)與細胞相關(guān)的所有熒光團，產(chǎn)生熒光發(fā)射。所有這些光被檢測器收集并通過流式細胞儀的電子元件進行處理。通過激光檢測點之后，流體系統(tǒng)會將不需要的細胞輸送到廢液桶中。在細胞分選儀中，細胞將在激光檢測點被分選和輸送到收集管中，以供后續(xù)實驗使用。