原代細(xì)胞的培養(yǎng)及建系之原代細(xì)胞取材篇

時間：2023/9/26閱讀：935

細(xì)胞的來源多樣，培養(yǎng)方法也各不相同，凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。原代細(xì)胞經(jīng)分散接種之手段稱為傳代。凡能經(jīng)傳代方式進(jìn)行再次培養(yǎng)的細(xì)胞稱為傳代細(xì)胞。若能穩(wěn)定生長傳至10~20代以上的細(xì)胞可確立為細(xì)胞系。若有條件能開展單細(xì)胞克隆、純化，經(jīng)大量擴增后所形成的生物學(xué)特性穩(wěn)定的克隆化細(xì)胞群，稱之為細(xì)胞株或克隆細(xì)胞。此過程稱為細(xì)胞的純化或細(xì)胞克隆。這些基本技術(shù)是從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的基礎(chǔ)，只有熟悉和掌握了基本技術(shù),才可能更快捷地學(xué)習(xí)和掌握其他方法,本章重點敘述常用的基本技術(shù)。
第一節(jié) 原代細(xì)胞的取材
人和動物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件，是進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的第一步，若取材不當(dāng)，將會直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)，現(xiàn)將取材的基本要求和注意事項敘述如下：
一、取材的基本要求
（1）取材要注意新鮮和保鮮新鮮組織易于培養(yǎng)成功，取材時應(yīng)盡量在4~6h內(nèi)能制作成細(xì)胞，盡快入箱培養(yǎng)，若不能即時培養(yǎng)，應(yīng)將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，于4℃存放。若組織塊較大，應(yīng)在清除表面血液、壞死組織、脂肪和結(jié)締組織后，切碎于培養(yǎng)液內(nèi)4℃存放，但時間不能超過24h。對于已切碎的組織或血液、淋巴組織應(yīng)加入含10%二甲基亞砜的培養(yǎng)基，按細(xì)胞凍存方式于液氮中冷凍保存。
（2）取材應(yīng)嚴(yán)格無菌所取標(biāo)本材料應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，為了確保無菌，對所取材料若疑有污染的可能，應(yīng)將所取組織在含高濃度抗菌素（400單位/mL）甚至加入適量的兩性霉素B或10%達(dá)克寧液的培養(yǎng)液內(nèi)于4℃下存放2小時以上，再用PBS洗2~3次，以確保所取材料無菌。要用無菌包裝的器皿或事先消毒好的帶少許培養(yǎng)液（內(nèi)含400單位/mL抗菌素）的小瓶等便于攜帶的物品來取材，所取材料應(yīng)避免接觸有毒有害的化學(xué)物質(zhì)，如碘、汞等。
（3）取材和原代細(xì)胞制作時，要用鋒利的器械，如手術(shù)刀或剃須刀片切碎組織，盡可能減少對細(xì)胞的機械損傷。
（4）要仔細(xì)去除所取材料上的血液、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織，切碎組織時應(yīng)避免組織干燥，可在含少量培養(yǎng)液的器皿中進(jìn)行。
（5）取材應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等，一般來講，胚胎組織較成熟個體組織容易培養(yǎng)，分化低的較分化高的組織容易生長，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。取材時應(yīng)盡量選用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)。
（6）原代細(xì)胞取材時要同時留好組織學(xué)標(biāo)本和電鏡標(biāo)本。對組織的來源、部位、包括供體的一般情況要做詳細(xì)的記錄，以備以后查詢。
二、各類組織的取材技術(shù)
(一) 皮膚和粘膜的取材
皮膚和粘膜是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的重要組織來源，主要取自于手術(shù)過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般2~4cm2即可，這樣局部沒有疤痕，若對燒傷皮膚進(jìn)行上皮細(xì)胞膜片移植，可從大腿或臀部取較大皮片，可取2~4cm2皮片，但取材時不要用碘酒消毒；若培養(yǎng)上皮細(xì)胞，取材時不要切取太厚，盡可能去除所攜帶的皮下或粘膜下組織；若欲培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，則反之。皮膚粘膜與外界相通部位，因表面細(xì)菌、霉菌很多，取材時應(yīng)嚴(yán)格消毒，必要時要用高濃度抗菌素和適量兩性霉素B漂洗、浸泡。
(二)內(nèi)臟和實體瘤的取材
內(nèi)臟除消化道外基本是無菌的，但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實體瘤取材時要取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締組織，否則培養(yǎng)后，由于成纖維細(xì)胞的生長給以后的培養(yǎng)工作增加困難。對于一些特殊細(xì)胞培養(yǎng)的取材，詳見后面有關(guān)章節(jié)。
(三)血液細(xì)胞的取材
血液及淋巴組織中的血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等）分離細(xì)胞，取材時應(yīng)注意抗凝，通常采用肝素抗凝，常用肝素濃度為8~10u/mL血，抽血的針筒也要用肝素濕潤，若從血站取來的獻(xiàn)血員的血液，因血站不用肝素抗凝劑，常用含枸椽酸鹽抗凝，對此類血標(biāo)本千萬不能用含鈣、鎂離子的洗液來處理細(xì)胞，因此時的鈣、鎂離子可加速血液中凝血酶促進(jìn)血液凝固而影響收獲血細(xì)胞及淋巴細(xì)胞。此外要嚴(yán)格無菌，盡量新鮮使用。
(四)骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材
取上述標(biāo)本時，除嚴(yán)格無菌，注意抗凝外，還要盡快分離培養(yǎng)，一般無需其他處理，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。具體操作詳見后面有關(guān)章節(jié)。
(五)動物組織取材
1、鼠胚組織取材
首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后（注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內(nèi)，影響組織活力），取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。
2、幼鼠胚腎（或肺）取材
幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開至兩側(cè)：然后采用無菌法打開胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開游離并拉向兩側(cè)，然后采用無菌法從背部打開腹腔取腎。
(六)人胚體組織取材
在局部先用碘酒后用75%酒精棉球消毒，無菌法取人胚肺（腎），方法與鼠類相同。
(七)雞（鴨）鳥類胚胎組織取材
取孵化至適當(dāng)胚齡（9~12天）的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋，說明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干，經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或中號鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼，再用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚，再用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。

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