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一、永生化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞簡介：雖然原代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞最更能真實地反映骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在人體內(nèi)的生理狀態(tài)，但是一方面原代分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞周期長及對技術(shù)人員經(jīng)驗要求較高，另一方面此原代細(xì)胞在體外的生長增殖能力非常緩慢有限，以至于此細(xì)胞不能多次傳代，這些不利因素制約了原代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在實驗室的廣泛應(yīng)用

一、永生化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞簡介：

雖然原代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞最更能真實地反映骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在人體內(nèi)的生理狀態(tài)，但是一方面原代分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞周期長及對技術(shù)人員經(jīng)驗要求較高，另一方面此原代細(xì)胞在體外的生長增殖能力非常緩慢有限，以至于此細(xì)胞不能多次傳代，這些不利因素制約了原代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在實驗室的廣泛應(yīng)用。我公司的研究團隊擁有多年原代細(xì)胞分離培養(yǎng)及細(xì)胞永生化服務(wù)研究經(jīng)驗，成功建立了永生化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點而日益受到人們的關(guān)注。如間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。
本公司生產(chǎn)的永生化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采用密度梯度離心及基因轉(zhuǎn)染制備而來，細(xì)胞總量約為1×10⁶/T25方瓶，細(xì)胞純度可達90%以上，且不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。
二、使用方法

1 、您收到細(xì)胞后，請按照以下方法進行操作：
取出 T25 方瓶， 75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入 37℃ , 5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置 2-3 小時，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后打開瓶子回收瓶子中培養(yǎng)液作為后續(xù)培養(yǎng)此細(xì)胞的培養(yǎng)液（備注：先使用瓶子中培養(yǎng)液培養(yǎng)及盡快凍存保種細(xì)胞，保存種子后再嘗試自己完全培養(yǎng)液培養(yǎng)觀察是否適合此細(xì)胞生長，以免使用自己培養(yǎng)液不適合細(xì)胞生長造成細(xì)胞狀態(tài)不好或死亡） ，最后按照后面細(xì)胞傳代步驟進行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。
2 、細(xì)胞傳代：
1）細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的 90%面積時，棄 T25 方瓶中的培養(yǎng)液，用 PBS 清洗細(xì)胞 3 次；
2）添加 0.25%消化液約 2ml 至培養(yǎng)瓶中 37 度培養(yǎng)箱放置 3-5 分鐘，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞基本脫落后加入培養(yǎng)基終止消化，用滴管混勻并將懸液轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管中，1000rpm/min，離心 5min；
3）棄上清，沉淀細(xì)胞用 10ml 培養(yǎng)基重懸，然后按 1:2 比例進行分瓶傳代，最后放入 37℃ ,5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）待細(xì)胞貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進行換液培養(yǎng)或傳代。
3 、細(xì)胞凍存：
1）細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的 90%面積時，棄 T25 方瓶中的培養(yǎng)液，用 PBS 清洗細(xì)胞 3 次；
2）添加 0.25%消化液約 2ml 至培養(yǎng)瓶中 37 度培養(yǎng)箱放置 3-5 分鐘，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞基本脫落后加入培養(yǎng)基終止消化，用滴管混勻并將懸液轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管中，1000rpm/min，離心 5min；
3）用適當(dāng)量的凍存液（培養(yǎng)液： FBS：DMSO=7:2:1）重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；
4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1h，然后將其移入-80℃過夜， 24h 后轉(zhuǎn)入液氮中進行長期儲存（或者按照梯度程序降溫模式直接放置-80 度凍存后并轉(zhuǎn)移液氮中長期儲存）。
4、細(xì)胞復(fù)蘇：
1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具），快速將其置入 37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結(jié)晶，然后用 75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2）將凍存管中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含 5ml 培養(yǎng)液無菌離心管中，1000rpm 離心 5min ，然后加入 5ml 完全培養(yǎng)液混勻細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 T25 培養(yǎng)瓶中，放置于 37℃ , 5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
3）第二天，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

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