PriCells: 利用Hoechst 33342外流性質(zhì)分選原代角膜間質(zhì)干細胞

試劑和材料：
1. 2—4代的間質(zhì)細胞；
2. HBSS/2FB；
3. Hoechst 33342染料，1mg/ml水溶；
4. 碘化丙啶（PI），2mg/ml水溶；
5. 維拉帕米，500μg/ml水溶；
6. DEME/2FB；
7. 胰蛋白酶/TrypLE：TrypLE Express或0.25%胰蛋白酶，溶于CMF-Saline G；
8. MoFlo（或與其類似的）高速細胞分選儀，具備350nm激發(fā)能力；

實驗方法：
1. 用PriCells原代細胞分離試劑盒2—4代的間質(zhì)細胞；
2. 細胞計數(shù)，用DMEM/2FB將細胞稀釋至1×10⁶/cm2個細胞/ml；
3. 加入5μg/ml Hoechst 33342染料，37℃，90min，每20min攪動一次；
4. 對照組細胞在加入Hoechst 33342染料前，先加入50μg/ml維拉帕米孵育20min；
5. 染色后，在4℃環(huán)境下用HBSS/2FB將細胞洗兩遍并離心，之后在冰上用冷HBSS/2FB重懸細胞；
6. 于分選前加入2μg/ml PI以鑒別無活性的細胞；
7. 無菌條件下分選細胞，高速細胞分選儀，用350nm激發(fā)。收集藍色（670nm）和紅色（450nm）熒光均減弱的細胞。邊群細胞通過上述步驟與死細胞和*被染料標記的細胞分離開并被收集起來。對照組要確保用維拉帕米先行孵育后使邊群細胞消失；