脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）作為RNA的臨床先進(jìn)遞送系統(tǒng)，已在癌癥治療、蛋白質(zhì)替代療法、自身免疫性疾病治療以及冠狀病毒傳染病等傳染病的mRNA疫苗中展現(xiàn)出巨大潛力。然而，LNPs在遞送過(guò)程中面臨的一個(gè)主要生物學(xué)障礙是內(nèi)體逃逸效率低，通常低于10%。盡管離子化脂質(zhì)在酸性內(nèi)體環(huán)境中能夠促進(jìn)膜融合，但天然存在的磷脂如DSPC和DOPE的功能尚未被充分理解，且很少有研究通過(guò)化學(xué)工程手段改善其功能性。本研究旨在設(shè)計(jì)一種新型兩性離子磷脂，通過(guò)誘導(dǎo)立方相的形成，提高LNPs的內(nèi)體逃逸效率，從而改善mRNA的功能性遞送。
材料與方法
1.1 材料：
DOPE-Cx系列磷脂通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)合成。CL4F6作為一種pH敏感的陽(yáng)離子脂質(zhì)，用于構(gòu)建LNPs。其他試劑如DSPC、DOPE、POPC、PEG-DMG等均購(gòu)自商業(yè)供應(yīng)商。- LNPs的制備：采用微流控混合技術(shù)，將含有CL4F6、磷脂、膽固醇和PEG-DMG的乙醇溶液與含有mRNA的醋酸鹽緩沖液混合，制備LNPs。通過(guò)透析和超濾步驟純化LNPs。
- LNPs的表征：使用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)量LNPs的粒徑、多分散指數(shù)（PDI）和ζ電位。通過(guò)核磁共振磷譜（31P NMR）和小角X射線散射（SAXS）分析脂質(zhì)相行為。
- 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：采用BALB/c小鼠模型，通過(guò)尾靜脈注射LNPs，評(píng)估m(xù)RNA在肝臟中的表達(dá)水平。使用生物發(fā)光成像系統(tǒng)（IVIS）監(jiān)測(cè)LNPs在體內(nèi)的分布。
Figure 1. Strategy and structure of DOPE-Cx.結(jié)果與討論
2.1 DOPE-Cx對(duì)mRNA遞送效率的影響：體內(nèi)mRNA表達(dá)水平評(píng)估：為了評(píng)估DOPE-Cx磷脂對(duì)mRNA遞送效率的影響，我們制備了含有不同磷脂（DSPC、DOPE、以及一系列DOPE-Cx變體）的脂質(zhì)納米顆粒（LNPs），并通過(guò)尾靜脈注射到BALB/c小鼠體內(nèi)。6小時(shí)后，收集小鼠肝臟組織，通過(guò)熒光素酶（Fluc）活性檢測(cè)來(lái)評(píng)估m(xù)RNA的表達(dá)水平。
- DSPC與DOPE對(duì)照組：與含有DSPC的LNPs相比，含有DOPE的LNPs并未顯著提高mRNA的表達(dá)水平，這表明單純替換DSPC為DOPE并不能有效改善mRNA的遞送效率。
- DOPE-Cx變體：引人注目的是，含有DOPE-Cx變體（特別是DOPE-C6、C8和C10）的LNPs顯著提高了mRNA在肝臟中的表達(dá)水平。其中，DOPE-C8表現(xiàn)出最高的mRNA表達(dá)水平，相較于DSPC對(duì)照組，其Fluc活性提高了數(shù)倍。
- 鏈長(zhǎng)依賴性：進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，DOPE-Cx磷脂的疏水鏈長(zhǎng)度對(duì)mRNA表達(dá)水平有顯著影響。較短的疏水鏈（如C4和C6）和較長(zhǎng)的疏水鏈（如C12和C18:1）均未能達(dá)到與DOPE-C8相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平，表明存在一個(gè)最佳的疏水鏈長(zhǎng)度范圍。
Figure 2. Impact that the chemical structure of DOPE-Cx exerts on the hepatic delivery of mRNA.EGFP表達(dá)驗(yàn)證：為了驗(yàn)證mRNA序列的獨(dú)立性，我們還制備了含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）編碼mRNA的LNPs，并觀察了其在肝臟組織中的表達(dá)情況。與Fluc表達(dá)結(jié)果一致，含有DOPE-C8的LNPs顯著誘導(dǎo)了EGFP在肝臟中的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了DOPE-Cx磷脂在提高mRNA遞送效率方面的有效性。細(xì)胞類型鑒定：通過(guò)免疫熒光染色，我們發(fā)現(xiàn)mRNA主要在肝細(xì)胞中表達(dá)，這表明DOPE-Cx磷脂能夠有效地將mRNA遞送至目標(biāo)細(xì)胞類型。2.2 DOPE-Cx的脂質(zhì)相行為分析：31P NMR分析：為了深入理解DOPE-Cx磷脂如何影響LNPs的脂質(zhì)相行為，我們采用了31P核磁共振（NMR）技術(shù)。將DOPE-Cx磷脂與磷脂酰膽堿（POPC）以不同摩爾比混合，并制備成脂質(zhì)懸浮液進(jìn)行NMR分析。
層狀相與非層狀相：純DOPE在與POPC混合時(shí)，迅速?gòu)牧较啵℉相）轉(zhuǎn)變?yōu)閷訝钕啵↙相）。然而，DOPE-Cx磷脂在與POPC混合時(shí)，能夠誘導(dǎo)形成非層狀立方相（Q相），這在NMR譜圖中表現(xiàn)為在0 ppm處出現(xiàn)尖銳的峰。
鏈長(zhǎng)與相行為：進(jìn)一步的分析表明，DOPE-Cx磷脂的疏水鏈長(zhǎng)度對(duì)其誘導(dǎo)立方相的能力有顯著影響。較短的疏水鏈（如C4至C8）更有利于立方相的形成，而較長(zhǎng)的疏水鏈則傾向于形成六方相。
Figure 3. Analysis of the lipid phase of DOPE-Cx lipid mixed with POPC.
SAXS與Cryo-TEM驗(yàn)證：為了進(jìn)一步驗(yàn)證DOPE-Cx磷脂誘導(dǎo)立方相的形成，我們采用了小角X射線散射（SAXS）和冷凍透射電子顯微鏡（Cryo-TEM）技術(shù)。
為了評(píng)估DOPE-Cx磷脂在體內(nèi)的代謝情況，我們采用了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC/MS）技術(shù)。在注射含有DOPE-C8的LNPs后不同時(shí)間點(diǎn)收集小鼠肝臟組織，并測(cè)定DOPE-C8的濃度。結(jié)果顯示，DOPE-C8在肝臟中的濃度迅速下降，半衰期較短（約1.83小時(shí)），表明其不易在體內(nèi)積累。此外，通過(guò)血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DOPE-C8在血清中容易被酯酶降解，生成無(wú)毒的代謝產(chǎn)物。這些詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明了DOPE-Cx磷脂在提高mRNA遞送效率方面的有效性，并展示了其在體內(nèi)的安全性和良好的代謝特性。
Figure 4. Characterization of DOPE-C8-LNPs.
結(jié)論
本研究成功設(shè)計(jì)并合成了一種新型立方相誘導(dǎo)的兩性離子磷脂DOPE-Cx，通過(guò)誘導(dǎo)立方相的形成，顯著提高了LNPs在肝臟中的mRNA遞送效率。此外，DOPE-Cx在體內(nèi)表現(xiàn)出良好的安全性和代謝特性，為mRNA治療應(yīng)用提供了新的策略。未來(lái)的研究將進(jìn)一步探索DOPE-Cx在其他組織中的遞送效率，并優(yōu)化其化學(xué)結(jié)構(gòu)以提高功能性。參考文獻(xiàn)：Iwakawa, Kazuki, et al. "Cubic Phase‐Inducible Zwitterionic Phospholipids Improve the Functional Delivery of mRNA." Advanced Science (2025): 2413016.
