土壤亞硝酸還原酶（Solid-Nitrite reductase，S-NiR）試劑盒說明書
微量法100T/48S
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
土壤亞硝酸還原酶是反硝化作用中的關(guān)鍵酶之一，參與亞硝酸鹽至NO的還原反應(yīng)，它的活性反映了生物降解過程中氮素的轉(zhuǎn)化效率，為氮素轉(zhuǎn)化規(guī)律的研究提供一定的依據(jù)。
測定原理：
亞硝酸還原酶可將NO2—還原為NO，使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO2—減少，即540nm處吸光值的變化可反應(yīng)土壤中亞硝酸還原酶的活性。
需自備的儀器和用品：
天平、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、水浴鍋、低溫離心機。
試劑的組成和配制：
試劑一：液體4mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加4mL蒸餾水溶解。
試劑三：液體4mL×1瓶，4℃保存。（如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解）
試劑四：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。（如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解）
試劑五：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。
工作液：臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以1:1的比例混合。
樣品處理：
新鮮土樣自然風(fēng)干或37度烘箱風(fēng)干，過30~50目篩。
測定操作表：
空白管 | 對照管 | 測定管 | |
風(fēng)干土樣（g） | 0.02 | 0.02 | |
蒸餾水（μL） | 40 | ||
試劑一（μL） | 40 | 40 | |
試劑二（μL） | 40 | 40 | 40 |
混勻后，25℃反應(yīng)1h | |||
試劑三（μL） | 40 | 40 | 40 |
充分震蕩30S，10000rpm，4℃，離心10min | |||
上清液（μL） | 70 | 70 | 70 |
工作液（μL） | 140 | 140 | 140 |
充分混勻，靜置3min后測定540nm處吸光值，分別記為A空白管、A對照管、A測定管。空白管只要做一管，每個測定管需設(shè)一個對照管。 | |||
計算公式
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線：y = 1.5562x+ 0.0088，R2 = 0.996；x為標準品濃度（μmol/mL），y為吸光值（A標準管-A空白管）。
酶活單位定義：每g土樣每天還原1μmol NO2ˉ 的量為一個酶活力單位。
S-NiR（μmol /d /g土樣）=[A空白管-(A測定管-A對照管) -0.0088]÷1.5562×V標÷W÷T
= 0.617×[A空白管-(A測定管-A對照管) -0.0088]÷W
T：反應(yīng)時間，1h=1/24d；V標：標準液體積，0.04mL；W：樣本質(zhì)量，g。
b. 使用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線：y = 0.7781x+ 0.0088，R2 = 0.996；x為標準品濃度（μmol/mL），y為吸光值（A標準管-A空白管）。
酶活單位定義：每g土樣每天還原1μmol NO2ˉ 的量為一個酶活力單位。
S-NiR（μmol /d /g土樣）=[A空白管-(A測定管-A對照管) -0.0088]÷0.7781×V標÷W÷T
= 1.234×[A空白管-(A測定管-A對照管) -0.0088]÷W
T：反應(yīng)時間，1h=1/24d；V標：標準液體積，0.04mL； W：樣本質(zhì)量，g。
注意事項：
1. 配制好的工作液3天內(nèi)使用完。
2. 若吸光值超過1.5，將上清液進行適當?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
3. 嚴格控制顯色時間，否則會對結(jié)果有影響。
4. 標準曲線線性范圍為0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。
5. A空白管-（A測定管-A對照管）線性范圍為0.02-1.5。
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