抗壞血酸氧化酶（ascorbate oxidase，AAO）活性測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
AAO是定位于植物細胞壁的糖蛋白，屬“藍銅氧化酶"家族。細胞壁內的抗壞血酸和AAO與細胞壁的代謝和生長有著密切的聯系。AAO 氧化 AsA 所形成的 MDHA 可通過質膜上的細胞色素b還原，該過程中電子的跨膜運輸能夠促進細胞生長。
測定原理：
AAO可直接氧化AsA，通過測定AsA的氧化量，可計算得AAO活力。
實驗中所需儀器及設備：
低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可調式移液器、研缽、冰、蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2mL蒸餾水充分溶解。
粗酶液提取：
按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。16000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。
AAO測定操作：
1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調節(jié)波長到265 nm。
2. 試劑二在25℃水浴鍋中預熱30 min。
3. 依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、170μL預熱的試劑二和10μL試劑三，迅速混勻后在265nm測定10s和130s光吸收A1和A2，△A =A1-A2。
AAO活性計算公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
AAO活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。
AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T
= 92.4×△A÷Cpr
(2). 按樣本質量計算
AAO活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。
AAO(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d）×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 92.4×△A÷W
ε：AsA在265nm處摩爾吸光系數為5.42×104 L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm； V反總：反應體系總體積（L），200μL=2×10-4 L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；W ：樣品質量；V樣：加入反應體系中上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；
T：催化反應時間（min），2min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
AAO活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。
AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T
=184.8×△A÷Cpr
(2). 按樣本質量計算
AAO活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。
AAO(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d）×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 184.8×△A÷W
ε：AsA在265nm處摩爾吸光系數為5.42×104 L/mol/cm；d：96孔板光徑（cm），0.5 cm； V反總：反應體系總體積（L），200μL=2×10-4 L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；W ：樣品質量；V樣：加入反應體系中上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；
T：催化反應時間（min），2min。
注意事項:
配制好的試劑放在4℃保存，三天內使用完。
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