羥自由基清除能力測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法100T/96S
注 意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
羥自由基作用于體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)等生物分子，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂引起疾病。羥自由基清除能力是樣品抗氧化能力的重要指標(biāo)之一，在抗氧化類(lèi)保健品和藥品研究中得到廣泛應(yīng)用。
測(cè)定原理：
H2O2/ Fe2+ 通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，將鄰二氮菲- Fe2+水溶液中Fe2+氧化為Fe3+ ，導(dǎo)致536nm吸光度下降，樣品對(duì)536nm吸光度下降速率的抑制程度，反映了樣品清除羥自由基的能力。
自備實(shí)驗(yàn)用品：
恒溫水浴鍋、酶標(biāo)儀、96孔板和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液：液體100 mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體12mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑二：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑三：液體12 mL×1瓶，4℃保存。
試劑四：液體6mL×1瓶，4℃保存。
樣品的制備：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2. 血清、果汁等液體樣品可直接測(cè)定。
3. 提取物（或者藥物）可配制成一定濃度，如5 mg/mL。
操作步驟：
1、 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至536nm。
2、 工作液配制：使用之前按照每管試劑一：試劑二：試劑三=100:50:100（µL）的比例配制，用多少配多少，混勻。
3、 在EP管中加入如下試劑
空白管 | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 | |
工作液（µL） | 250 | 250 | 250 |
混勻，防止局部顏色過(guò)濃 | |||
樣品（µL） | 50 | ||
試劑四（µL） | 50 | 50 | |
H2O（µL） | 100 | 50 | |
混勻，37℃保溫60min，8000g 25℃離心5min，吸取200μL于96孔板中測(cè)定536nm處吸光值，空白管、對(duì)照管和測(cè)定管的吸光值分別記為A空、A對(duì)和A測(cè)。 | |||
注意：空白管和對(duì)照管只需測(cè)定一次。
計(jì)算公式:
羥自由基清除率 D% =（A測(cè)-A對(duì)）÷（A空-A對(duì)）×100%
A空、A對(duì)、A測(cè)：空白管、對(duì)照管和測(cè)定管的吸光值。
注意事項(xiàng):
為了比較不同樣品羥自由基清除能力，對(duì)于同一批樣品必須加入等量的樣品，血清、組織勻漿、果汁等液體樣品加入同樣體積，提取物（或者藥物）配制成同樣濃度。
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