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WB實驗中單層貼壁總蛋白的提取方法

閱讀:488      發(fā)布時間:2024-9-24
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一、前言

蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色,通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的分子生物學(xué)技術(shù)。Western Blotting實驗單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取步驟:


WB實驗中單層貼壁總蛋白的提取方法

二、操作步驟

  1. 1. 倒掉培養(yǎng)液,并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液(或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。

  2. 2. 每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS0.01M pH=7.27.3)。平放輕輕搖動1min洗滌細(xì)胞,然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次,共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。

  3. 3. 按1ml裂解液加10μl PMSF100mM),搖勻置于冰上。(PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。)

  4. 4. 每瓶細(xì)胞加400μlPMSF的裂解液,于冰上裂解30min,為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。

  5. 5. 裂解完后,用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)(動作要快),然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。(整個操作盡量在冰上進(jìn)行。)

  6. 6. 于4℃12000 rpm離心5min。(提前開離心機預(yù)冷)

  7. 7. 將離心后的上清分裝到0.5min的離心管中放于-20℃保存。

  8. 以上步驟可簡單概述為:收集細(xì)胞、裂解細(xì)胞、離心取上清、保存。

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三、PBS推薦

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PBS速溶顆粒

5*1L;50*1L

BM28R04

PBS-T速溶顆粒

5*1L;50*1L

BM16017

PBS磷酸鹽緩沖液

500mL



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