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如何降低非特異性擴增?

閱讀:748      發(fā)布時間:2024-11-25
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一、擴增方式

擴增方式一般有兩種,對稱擴增和不對稱擴增。

1、對稱擴增

使用等量的引物進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物量隨著PCR循環(huán)呈指數(shù)增長,一般的PCR,使用的都是這種方式。

由于TaqDNA聚合酶具有5-3外切酶活性,在PCR擴增的過程中會水解探針,導致探針被耗盡,無法用于熔曲分析;若使用抗酶切修飾的探針,可一定程度降低水解,但由于探針阻礙了聚合酶通過,擴增效率會大幅下降。

對稱擴增產(chǎn)生的互補雙鏈,會與探針競爭結合靶序列,不利于探針結合到靶序列上,熔曲分析可能會出現(xiàn)異常。

優(yōu)點:靈敏度高

缺點:一般搭配使用媒介探針進行檢測,而其他類型探針由于被切割而無法使用。

2、不對稱擴增

上下游引物中,有一條引物為過量使用,一條引物xian使用,在PCR擴增的前期,擴增產(chǎn)物量呈指數(shù)增長,待xian引物耗盡,擴增產(chǎn)物量呈線性增長,產(chǎn)生大量的單鏈用于探針的結合和熔解曲線分析。

LATE-PCR方法中,由于考慮到引物濃度對引物Tm值的影響,xian引物由于濃度低,對模板的結合效率下降,從而影響不對稱擴增前期的擴增效率,因此對xian引物的Tm值進行了增加(即加多幾個堿基)。

優(yōu)點:不會消耗探針,探針可用于后續(xù)熔解曲線分析

缺點:靈敏度低,一般用于基因檢測,不適用于病原檢測(病原檢測需要高靈敏度)

二、如何降低非特異性擴增?

1、HANDS技術Homo-Tag Assisted Non-Dimer System,同源加尾無二聚體系統(tǒng))

通過對引物添加標簽,當形成引物二聚體后,由于首尾的序列互補,會形成發(fā)夾結構,不再作為模板進行擴增。

2、DPO引物Dual Priming Oligonucleotide,雙啟動寡核苷酸)

DPO引物主要由三個部分組成,長的 5'端片段、短的3'端片段、中間起連接作用的聚脫氧次黃嘌呤(poly I)。由于脫氧次黃嘌呤與天然堿基結合較弱,因此相當于與模板DNA形成了一個氣泡結構。

即使DPO引物的較長的 5'端部分結合到了非靶序列部位,但由于熱力學限制,3’端部分阻止了非特異結合并有效地阻斷了延伸。同樣由于熱力學限制,單獨的3'端部分在PCR退火溫度下不能結合到靶序列上。從而減少引物二聚體的擴增。

3、touch-down技術

即降落PCR,在退火階段,采用逐級降溫的方式,能有效減少非特異性擴增。溫度較高時,由于非特異性結合的結合力較弱,不利于非特異性擴增,特異性擴增占優(yōu)勢。


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