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一、引言

二、材料與方法

1. 細粒棘球絳蟲的獲取與預(yù)處理

• 細粒棘球絳蟲原頭蚴或幼蟲樣本來源于感染細粒棘球絳蟲的動物肝臟或其他寄生部位。在無菌條件下，將獲取的組織小心解剖，使用含有特定抗生素（如青霉素、鏈霉素）的生理緩沖液（如磷酸鹽緩沖液，PBS）反復(fù)沖洗，以去除雜質(zhì)和可能存在的細菌污染。然后，將蟲體置于含有適量營養(yǎng)成分（如葡萄糖、氨基酸等）的培養(yǎng)液中，在特定的溫度（如 37°C）和氣體環(huán)境（如 5% CO?）下培養(yǎng)一定時間，使蟲體處于適宜的生理狀態(tài)，以便后續(xù)電穿孔轉(zhuǎn)染操作。培養(yǎng)過程中，定期觀察蟲體的活力和形態(tài)變化，通過臺盼藍拒染法等手段檢測蟲體的存活率，確保用于轉(zhuǎn)染的蟲體具有較高的活性。

2. 干擾 RNA 的設(shè)計與合成

• 根據(jù)已確定的細粒棘球絳蟲靶基因序列，利用專業(yè)的 RNAi 設(shè)計軟件（如 siDirect 等）設(shè)計特異性的干擾 RNA 序列。設(shè)計原則包括選擇合適的靶位點（一般位于基因的編碼區(qū)，避免在 5' 和 3' 非翻譯區(qū)以及內(nèi)含子區(qū)域）、確保序列的特異性（通過與基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，避免與其他非靶基因序列有同源性）以及考慮干擾 RNA 的二級結(jié)構(gòu)（盡量減少自身形成復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的可能性）。設(shè)計完成后，委托專業(yè)的生物公司進行化學合成。合成后的干擾 RNA 經(jīng)過高效液相色譜法（HPLC）純化，以去除雜質(zhì)和可能存在的短片段 RNA。通過紫外分光光度計測定其濃度和純度，將其溶解于無核酸酶的水或合適的緩沖液中，儲存于 - 80°C 備用。

3. 電穿孔緩沖液的選擇與優(yōu)化

• 測試多種電穿孔緩沖液對細粒棘球絳蟲的適用性，如不同離子強度（如低滲、等滲、高滲）的磷酸鹽緩沖液、蔗糖緩沖液等。將蟲體分別置于不同的緩沖液中，在相同的電穿孔條件（如電壓、脈沖時間等暫設(shè)為固定值）下進行預(yù)實驗。通過觀察蟲體在電穿孔后的存活率（采用活 / 死細胞染色試劑盒檢測）以及后續(xù)培養(yǎng)中的生長狀態(tài)，評估不同緩沖液對蟲體的影響。選擇能夠在保證較高蟲體存活率的同時，有利于干擾 RNA 進入蟲體的緩沖液作為最終的電穿孔緩沖液，并進一步對其成分（如添加某些輔助因子，如二甲基亞砜，DMSO，以增強細胞膜的通透性）和濃度進行優(yōu)化。

4. 電穿孔參數(shù)的確定與優(yōu)化

• 采用電穿孔儀進行實驗，首先對電壓、脈沖時間、脈沖次數(shù)等電穿孔參數(shù)進行初步篩選。設(shè)置不同的電壓梯度（如 100 - 500V）、脈沖時間范圍（如 1 - 10ms）和脈沖次數(shù)（如 1 - 5 次）組合，將含有特定濃度干擾 RNA 的蟲體懸液與電穿孔緩沖液混合后，加入電穿孔杯進行電穿孔操作。電穿孔后，將蟲體轉(zhuǎn)移至新鮮的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一定時間，然后通過實時定量 PCR（qRT - PCR）檢測靶基因的表達水平，以確定能夠?qū)崿F(xiàn)最高基因沉默效率的電穿孔參數(shù)組合。在優(yōu)化過程中，還需要考慮不同參數(shù)之間的相互作用，例如，較高的電壓可能需要較短的脈沖時間以減少對蟲體的損傷，通過多因素實驗設(shè)計（如正交實驗）來全面評估參數(shù)的最佳組合。

5. 電穿孔轉(zhuǎn)染及后續(xù)檢測

• 將預(yù)處理后的細粒棘球絳蟲蟲體與適量的干擾 RNA（濃度根據(jù)預(yù)實驗確定，一般在 10 - 100nM）混合于優(yōu)化后的電穿孔緩沖液中，轉(zhuǎn)移至電穿孔杯。按照優(yōu)化后的電穿孔參數(shù)進行電穿孔操作。電穿孔完成后，立即將蟲體轉(zhuǎn)移至預(yù)熱的含有豐富營養(yǎng)成分和抗生素的培養(yǎng)液中，在適宜的培養(yǎng)條件下（如 37°C、5% CO?）培養(yǎng)。在不同的時間點（如 24 小時、48 小時、72 小時等）收集蟲體，提取總 RNA，采用 qRT - PCR 技術(shù)檢測靶基因的表達水平，以評估干擾 RNA 的基因沉默效果。同時，通過觀察蟲體的形態(tài)變化（如蟲體大小、結(jié)構(gòu)完整性等）、運動能力以及對宿主細胞的侵襲能力等表型變化，進一步驗證基因沉默對蟲體生物學特性的影響。此外，還可以采用 Western blotting 技術(shù)檢測靶蛋白的表達水平，從蛋白水平驗證干擾 RNA 的作用效果。

三、結(jié)果與分析

1. 電穿孔緩沖液優(yōu)化結(jié)果

• 經(jīng)過對多種電穿孔緩沖液的測試和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)一種等滲的磷酸鹽緩沖液添加一定濃度（如 0.5%）的 DMSO 時，蟲體在電穿孔后的存活率較高，可達 80% 以上，且在后續(xù)培養(yǎng)中生長狀態(tài)良好。與其他緩沖液相比，該緩沖液能夠顯著提高干擾 RNA 進入蟲體的效率，通過熒光標記的干擾 RNA 轉(zhuǎn)染實驗觀察到，在該緩沖液中，蟲體內(nèi)的熒光強度明顯高于其他緩沖液組，表明其更有利于干擾 RNA 的導(dǎo)入。

2. 電穿孔參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

• 通過多因素實驗設(shè)計優(yōu)化電穿孔參數(shù)，確定了電壓為 300V、脈沖時間為 5ms、脈沖次數(shù)為 3 次的組合能夠?qū)崿F(xiàn)最高的基因沉默效率。在該參數(shù)組合下，對靶基因進行 qRT - PCR 檢測，結(jié)果顯示與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染后 48 小時靶基因的表達水平下降了約 80%。同時，隨著時間的推移，基因沉默效果在 72 小時內(nèi)能夠維持相對穩(wěn)定，之后逐漸有所回升，但仍顯著低于未轉(zhuǎn)染組。

3. 電穿孔轉(zhuǎn)染效果評估

• 對電穿孔轉(zhuǎn)染干擾 RNA 后的細粒棘球絳蟲進行多方面檢測，發(fā)現(xiàn)除了靶基因表達水平顯著下降外，蟲體在形態(tài)上出現(xiàn)了一些變化，如蟲體體積變小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)略顯松散等。在運動能力方面，轉(zhuǎn)染后的蟲體運動速度明顯減慢，運動范圍也減小。對宿主細胞的侵襲能力檢測表明，轉(zhuǎn)染組蟲體的侵襲能力較未轉(zhuǎn)染組下降了約 60%。通過 Western blotting 檢測靶蛋白表達水平，結(jié)果與 qRT - PCR 檢測結(jié)果一致，進一步證實了干擾 RNA 通過電穿孔轉(zhuǎn)染成功地沉默了靶基因，并對蟲體的生物學特性產(chǎn)生了顯著影響。

四、結(jié)論與展望