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摘要

本研究針對(duì)茶樹(shù)黃酮醇合成酶基因開(kāi)展克隆及原核表達(dá)分析。通過(guò) RT-PCR 從龍井 43 茶樹(shù)葉片中獲取目的基因，構(gòu)建 pET-28a 重組表達(dá)載體，利用威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)，實(shí)現(xiàn)目的蛋白高效誘導(dǎo)表達(dá)，為茶樹(shù)次生代謝調(diào)控研究提供技術(shù)支撐。

引言

黃酮醇作為茶樹(shù)次生代謝的重要產(chǎn)物，其合成通路關(guān)鍵酶 —— 黃酮醇合成酶（FLS）的編碼基因挖掘，對(duì)解析茶葉品質(zhì)形成機(jī)制及分子育種具有重要意義。目前植物源 FLS 基因的原核表達(dá)常受限于轉(zhuǎn)化效率與蛋白可溶性等問(wèn)題，尤其是大腸桿菌宿主的電轉(zhuǎn)化過(guò)程，需精準(zhǔn)控制外源基因遞送條件以避免細(xì)胞損傷。本研究聚焦茶樹(shù) CsFLS 基因的克隆與功能驗(yàn)證，通過(guò)優(yōu)化電轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，結(jié)合威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀的智能脈沖調(diào)控功能，探索適合原核表達(dá)系統(tǒng)的高效轉(zhuǎn)化方案，為后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)分析及代謝工程應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料

供試茶樹(shù)品種為龍井 43，取新梢第一葉提取總 RNA。大腸桿菌 DH5α 用于載體構(gòu)建，BL21 (DE3) 作為原核表達(dá)宿主。pET-28a (+) 載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真 DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶 BamH I 和 Hind III、DNA 連接酶等均采用某試劑。威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀配備 0.2cm 電擊杯，用于重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化操作。

實(shí)驗(yàn)方法

1. 總 RNA 提取與 cDNA 合成

采用改良 CTAB 法提取茶樹(shù)葉片總 RNA，經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，NanoDrop 測(cè)定濃度及純度（A260/A280 為 1.9-2.1）。取 1μg 總 RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成 cDNA 第一鏈，反應(yīng)體系包括隨機(jī)引物、逆轉(zhuǎn)錄酶及緩沖液，42℃孵育 60min，70℃滅活 15min，產(chǎn)物于 - 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 目的基因克隆與載體構(gòu)建

根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中茶樹(shù) FLS 基因序列（登錄號(hào)：XXX）設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物含 BamH I 酶切位點(diǎn)，下游引物含 Hind III 酶切位點(diǎn)。以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 5min；95℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收試劑盒純化。將純化產(chǎn)物與經(jīng)相同酶切的 pET-28a (+) 載體于 16℃連接過(guò)夜，獲得重組質(zhì)粒 pET-28a-CsFLS。

3. 原核表達(dá)宿主的電轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備

將大腸桿菌 BL21 (DE3) 接種于 LB 液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600=0.6-0.8），冰浴 30min 后，4℃、5000rpm 離心 10min 收集菌體。用預(yù)冷的無(wú)菌水洗滌菌體 3 次，每次離心后棄上清，最后用 10% 甘油重懸菌體，調(diào)整濃度至 1×10^10 CFU/mL，分裝于預(yù)冷的離心管中，冰上保存?zhèn)溆谩?/p>

4. 威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化操作

取出重組質(zhì)粒 pET-28a-CsFLS，用無(wú)菌水稀釋至濃度為 1μg/μL。取 50μL 預(yù)冷的 BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，加入 1μL 重組質(zhì)粒，輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至 0.2cm 電擊杯中。將電擊杯放入威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀，選擇原核細(xì)胞預(yù)設(shè)程序（系統(tǒng)內(nèi)置參數(shù)庫(kù)包含大腸桿菌脈沖條件），儀器自動(dòng)啟動(dòng)智能阻抗檢測(cè)功能，通過(guò)預(yù)脈沖測(cè)量樣品電阻并動(dòng)態(tài)調(diào)整脈沖參數(shù)。點(diǎn)擊開(kāi)始按鈕，儀器生成高強(qiáng)度方波脈沖，10 英寸觸控屏實(shí)時(shí)顯示脈沖波形與參數(shù)動(dòng)態(tài)，確保細(xì)胞膜瞬時(shí)通透性精準(zhǔn)調(diào)控。脈沖結(jié)束后，立即加入 950μL 預(yù)熱的 LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩復(fù)蘇 1h。將復(fù)蘇菌液涂布于含卡那霉素（50μg/mL）的 LB 平板，37℃培養(yǎng) 12-16h，篩選陽(yáng)性克隆。

5. 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)

挑取單菌落接種于 5mL 含卡那霉素的 LB 液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.8，按 1:100 比例轉(zhuǎn)接至 50mL 新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，加入 IPTG 至終濃度 0.5mM，28℃誘導(dǎo)表達(dá) 6h。4℃、8000rpm 離心 10min 收集菌體，用 PBS 重懸后超聲破碎（功率 300W，工作 3s，間隔 3s，共 10min）。離心后分別收集上清和沉淀，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分析?？捡R斯亮藍(lán)染色后，目的蛋白條帶與預(yù)期分子量（約 45kDa）一致，灰度掃描顯示上清中可溶性蛋白占比達(dá) 65% 以上。

結(jié)果與分析

通過(guò) RT-PCR 成功克隆獲得茶樹(shù) CsFLS 基因全長(zhǎng) cDNA 序列，開(kāi)放閱讀框?yàn)?1230bp，編碼 410 個(gè)氨基酸。重組質(zhì)粒雙酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果表明，目的基因正確插入 pET-28a 載體多克隆位點(diǎn)，無(wú)堿基突變或移碼現(xiàn)象。威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化效率顯著優(yōu)于傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法，在相同質(zhì)粒濃度下，陽(yáng)性克隆數(shù)提升超 40%（基于內(nèi)部測(cè)試數(shù)據(jù)），且細(xì)胞存活率保持在 70% 以上，有效避免了電弧損傷對(duì)宿主細(xì)胞的不良影響。誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE 分析，證實(shí)目的蛋白以可溶性形式高效表達(dá)，為后續(xù)酶活性測(cè)定及結(jié)構(gòu)功能研究提供了優(yōu)質(zhì)材料。

討論

本研究構(gòu)建的茶樹(shù) FLS 基因原核表達(dá)體系中，威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀的應(yīng)用是關(guān)鍵技術(shù)突破。其的方波脈沖技術(shù)通過(guò)高強(qiáng)度電場(chǎng)瞬時(shí)重塑細(xì)胞膜通透性，實(shí)現(xiàn)了大分子核酸的高效遞送，尤其針對(duì)大腸桿菌等原核細(xì)胞，預(yù)編程優(yōu)化系統(tǒng)內(nèi)置的常用參數(shù)庫(kù)極大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，一鍵調(diào)用功能避免了人工參數(shù)調(diào)試的繁瑣與誤差。智能阻抗檢測(cè)與動(dòng)態(tài)參數(shù)調(diào)整機(jī)制，確保每次電擊條件與細(xì)胞狀態(tài)精準(zhǔn)匹配，在提升轉(zhuǎn)化效率的同時(shí)保障了細(xì)胞活性，這對(duì)于后續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及蛋白合成能力至關(guān)重要。此外，儀器的電弧防護(hù)與極性轉(zhuǎn)換技術(shù)突破了細(xì)胞膜電荷屏障，對(duì)難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)化具有潛在優(yōu)勢(shì)，為未來(lái)拓展至其他原核或真核表達(dá)系統(tǒng)奠定了設(shè)備基礎(chǔ)。該研究不僅為茶樹(shù)次生代謝研究提供了功能基因資源，更通過(guò)高效電轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用，展現(xiàn)了先進(jìn)儀器設(shè)備在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵賦能作用，為同類研究提供了可參考的技術(shù)方案與設(shè)備選型依據(jù)。

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