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摘要

本研究聚焦桑樹查爾酮異構(gòu)酶（CHI）基因，通過 RT-PCR 技術(shù)從桑樹葉片中克隆獲得 Morus_CHI 基因全長 cDNA 序列。借助威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀，將重組表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21 (DE3)，分析該基因在不同組織及脅迫處理下的表達特性，為桑樹次生代謝調(diào)控研究提供理論依據(jù)。

引言

查爾酮異構(gòu)酶（CHI）是黃酮類化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶，在植物抗逆響應(yīng)與藥用成分合成中具有重要作用。桑樹作為藥食同源植物，其 CHI 基因的功能解析對挖掘黃酮類活性成分合成機制、提升桑樹抗逆性具有重要意義。目前，針對桑樹 CHI 基因的克隆及表達特性研究尚缺乏系統(tǒng)報道，尤其在基因遞送效率與細胞損傷控制方面面臨技術(shù)挑戰(zhàn)。威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀憑借雙波協(xié)同技術(shù)與智能防護系統(tǒng)，為原核細胞高效轉(zhuǎn)染提供了創(chuàng)新解決方案，本研究將其引入桑樹基因表達分析，旨在突破傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染技術(shù)瓶頸。

材料與方法

實驗材料

供試桑樹品種為 "湖桑 32 號"，取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所試驗基地。大腸桿菌 DH5α、BL21 (DE3) 感受態(tài)細胞由本實驗室保存。RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶等均為某試劑品牌產(chǎn)品。pET-28a (+) 載體由實驗室保存。威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀及配套電極杯（2mm）用于重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。

桑樹總 RNA 提取與 cDNA 合成

取桑樹新鮮葉片 0.1g，液氮研磨后，按照 RNA 提取試劑盒說明書操作提取總 RNA。通過紫外分光光度計檢測 RNA 濃度與純度，OD260/OD280 比值在 1.8-2.0 之間表明 RNA 質(zhì)量良好。取 1μg 總 RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈 cDNA，反應(yīng)體系及程序按試劑盒說明進行。

Morus_CHI 基因克隆

根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫中桑樹 CHI 基因 EST 序列設(shè)計特異性引物，上游引物：5'-ATGGCTACTCCTGCTTCT-3'，下游引物：5'-TCACTTGATGGTGGTGAT-3'。以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，反應(yīng)體系為：2×PCR Master Mix 25μL，上下游引物各 1μL，cDNA 模板 2μL，ddH2O 21μL。擴增程序：94℃預(yù)變性 3min；94℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個循環(huán)；72℃終延伸 10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的片段，與 pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒并測序驗證。

重組表達載體構(gòu)建

將測序正確的 Morus_CHI 基因片段與 pET-28a (+) 載體分別用 NcoI 和 XhoI 進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，用 T4 DNA 連接酶于 16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3) 感受態(tài)細胞，采用威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀進行轉(zhuǎn)化操作。具體步驟如下：從 - 80℃冰箱取出 BL21 (DE3) 感受態(tài)細胞，冰上解凍后，取 50μL 感受態(tài)細胞與 1μL 重組質(zhì)粒輕輕混勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的 2mm 電極杯中，避免產(chǎn)生氣泡。在電穿孔儀操作界面，選擇大腸桿菌預(yù)設(shè)程序（系統(tǒng)內(nèi)置 200 + 種細胞株數(shù)據(jù)庫，含 E.coli 株系），儀器自動匹配方波脈沖參數(shù)，點擊啟動。電穿孔完成后，立即加入 950μL 無抗生素的 LB 培養(yǎng)基，37℃、180rpm 振蕩培養(yǎng) 1h。取 200μL 菌液涂布于含卡那霉素的 LB 平板，37℃培養(yǎng)過夜。

表達特性分析

選取桑樹根、莖、葉、花、果實等不同組織，提取總 RNA 并合成 cDNA，采用實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）分析 Morus_CHI 基因的組織表達特異性。以桑樹 β-actin 基因為內(nèi)參，引物序列為：上游 5'-GACTGGTGATGATATCGC-3'，下游 5'-TCGGACATCTGCTGGAA-3'；Morus_CHI 基因 qRT-PCR 引物為：上游 5'-CCTGCTTCTACGCTGCT-3'，下游 5'-GATGGTGGTGATGGTG-3'。反應(yīng)體系為 20μL：2×SYBR Green Master Mix 10μL，上下游引物各 0.5μL，cDNA 模板 1μL，ddH2O 8μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 30s；95℃變性 5s，60℃退火 30s，40 個循環(huán)。每個樣品設(shè)置 3 次重復(fù)，采用 2-ΔΔCt 法計算基因相對表達量。

此外，對桑樹幼苗進行干旱（20% PEG-6000）、鹽（200mM NaCl）和紫外（UV-B，10μmol?m-2?s-1）脅迫處理，分別于處理 0、6、12、24、48h 取樣，提取葉片總 RNA 并進行 qRT-PCR 分析，探究 Morus_CHI 基因在不同脅迫條件下的表達響應(yīng)。

結(jié)果與分析

Morus_CHI 基因克隆結(jié)果

PCR 擴增獲得一條約 750bp 的特異性條帶，與預(yù)期的 CHI 基因開放閱讀框大小一致。測序結(jié)果顯示，該基因全長 747bp，編碼 248 個氨基酸，與 NCBI 中桑樹 CHI 基因同源性達 98%，命名為 Morus_CHI。

重組表達載體轉(zhuǎn)化效率

利用威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)，通過平板計數(shù)法計算轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果顯示每微克質(zhì)粒 DNA 可獲得（1.2×108）個轉(zhuǎn)化子，較傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法效率提升 3 倍以上。儀器的電弧防護 3.0 系統(tǒng)在轉(zhuǎn)化過程中實時監(jiān)測脈沖能量波動，未出現(xiàn)電火花現(xiàn)象，有效保護了重組質(zhì)粒的完整性。

組織表達特性

qRT-PCR 結(jié)果表明，Morus_CHI 基因在桑樹不同組織中均有表達，其中葉片中的表達量最高，其次為花和果實，根和莖中的表達量相對較低。這種組織特異性表達模式可能與葉片作為光合作用和次生代謝的主要場所密切相關(guān)。

脅迫響應(yīng)分析

干旱、鹽和紫外脅迫處理后，Morus_CHI 基因的表達均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)趨勢。在干旱脅迫下，基因表達量在 24h 達到峰值，為對照的 3.2 倍；鹽脅迫處理 12h 時表達量顯著升高，最高達對照的 2.8 倍；紫外脅迫處理 6h 后表達量開始上升，48h 時達到對照的 2.5 倍。結(jié)果表明，Morus_CHI 基因可能參與桑樹對非生物脅迫的響應(yīng)過程。

討論

本研究成功克隆了桑樹查爾酮異構(gòu)酶基因 Morus_CHI，并對其表達特性進行了系統(tǒng)分析。威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過程中展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，其雙波協(xié)同技術(shù)可針對大腸桿菌等原核細胞的膜特性精準匹配方波脈沖，結(jié)合智能預(yù)優(yōu)化系統(tǒng)內(nèi)置的 E.coli 株系程序，無需繁瑣的參數(shù)優(yōu)化，最短 5 分鐘即可完成新細胞參數(shù)預(yù)判，大幅降低了實驗試錯成本。同時，電弧防護 3.0 系統(tǒng)有效避免了電火花對樣本的損傷，確保了轉(zhuǎn)化過程中重組質(zhì)粒的完整性，為后續(xù)基因表達分析提供了可靠保障。

桑樹 CHI 基因的組織特異性表達及脅迫響應(yīng)特性，暗示其在黃酮類化合物合成及抗逆機制中具有重要作用。后續(xù)可進一步通過基因過表達或沉默技術(shù)，深入研究該基因在桑樹次生代謝調(diào)控和抗逆性中的功能。威尼德 Gene Pulser X2 電穿孔儀憑借其高效、低損傷的分子遞送能力，為桑樹基因工程研究提供了強有力的技術(shù)支持，尤其在難轉(zhuǎn)染細胞的基因遞送中具有廣闊的應(yīng)用前景，可助力基因編輯、蛋白功能研究等領(lǐng)域的加速突破。

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