膜蛋白在細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖分化等許多生命活動(dòng)中起著非常重要的作用，是重要的藥物靶點(diǎn)。然而，由于表達(dá)量低、構(gòu)象不穩(wěn)定、難分離純化等原因，許多研究受限于膜蛋白難表達(dá)而止步不前。
山東農(nóng)業(yè)大學(xué)某課題組就遇到這樣一個(gè)難題：某膜蛋白用原核體系難以表達(dá)，經(jīng)過(guò)兩年時(shí)間反復(fù)嘗試，仍未攻克難關(guān)。
珀羅汀生物基于自主研發(fā)的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)（CFPS）系統(tǒng)，已成功表達(dá)多例全長(zhǎng)跨膜蛋白。該課題組慕名而來(lái)，在進(jìn)一步了解CFPS技術(shù)以及珀羅汀生物在無(wú)細(xì)胞領(lǐng)域的技術(shù)優(yōu)勢(shì)之后，決定委托珀羅汀生物，利用CFPS平臺(tái)嘗試表達(dá)該膜蛋白。
測(cè)試方法
收到客戶質(zhì)粒后，珀羅汀生物研發(fā)人員立即著手構(gòu)建線性表達(dá)模板，為了直接觀測(cè)目標(biāo)膜蛋白的表達(dá)情況并提高其可溶性，研發(fā)人員還構(gòu)建了融合GFP的表達(dá)模板。隨后，采用專研的針對(duì)膜蛋白的CFPS體系（即PLDK002試劑盒來(lái)源體系），并添加去垢劑【1】，于收到質(zhì)粒當(dāng)天完成無(wú)細(xì)胞反應(yīng)體系構(gòu)建。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
組別 | NC | A1 | A2 | B1 | B2 |
是否融合GFP | - | - | - | + | + |
是否添加去垢劑 | - | - | + | - | + |
純化標(biāo)簽 | - | His標(biāo)簽 | |||
注：【1】該去垢劑是依據(jù)珀羅汀生物膜蛋白表達(dá)案例庫(kù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選出。
測(cè)試結(jié)果
圖1融合GFP的目標(biāo)膜蛋白在照膠儀下發(fā)出綠色熒光
次日，取反應(yīng)后上清，進(jìn)行親和純化、表達(dá)鑒定。如圖1所示，B1、B2兩組在照膠儀下均發(fā)出綠色熒光，提示融合GFP的目標(biāo)膜蛋白無(wú)論是否添加去垢劑，均可在CFPS體系的上清液中可溶表達(dá)！
圖2 目標(biāo)膜蛋白SDS-PAGE結(jié)果圖
經(jīng)考染、脫色后，如圖2所示，未融合GFP的目標(biāo)膜蛋白（A1、A2組）同樣在上清液中可溶表達(dá)！此外，分別對(duì)比A1、A2組與B1、B2組可以發(fā)現(xiàn)，添加去垢劑可促進(jìn)該膜蛋白的可溶表達(dá)。
總結(jié)
珀羅汀CFPS系統(tǒng)不負(fù)眾望，兩天之內(nèi)，成功表達(dá)了困擾該課題組長(zhǎng)達(dá)兩年的膜蛋白，“難表達(dá)蛋白的救星"名副其實(shí)！本次實(shí)驗(yàn)的成功，再次顯示出珀羅汀CFPS技術(shù)在膜蛋白等難度蛋白表達(dá)領(lǐng)域中的絕倫。
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