一 嚴格的質(zhì)量控制
高特異性設(shè)計
采用巢式PCR（支原體檢測）或探針法（立克次氏體），通過多輪引物擴增或雜交探針避免非特異性結(jié)合。
針對保守基因區(qū)域設(shè)計引物（如支原體rRNA操縱子），確保僅靶標序列被擴增。
靈敏度優(yōu)化
檢出限達10ng（鮑曼不動桿菌），并通過標準曲線法和ROC曲線評估靈敏度與特異性[8]。
二 標準化操作流程
防污染措施
超凈工作臺配制反應(yīng)體系，使用核酸清除劑（如Minerva PCR Clean™）。
分區(qū)分裝試劑，更換槍頭/手套避免交叉污染。
樣本處理規(guī)范
DNA提取專用試劑盒（支原體），模板量控制（如cDNA≤10%體系）。
樣本低溫保存（液氮/Trizol），運輸需符合生物安全要求。
三 驗證與質(zhì)控
多重驗證指標
實驗階段測試靈敏度/重復(fù)性（諾如病毒研發(fā)）；臨床試驗驗證實際性能。
內(nèi)參染料（如ROX）校正孔間誤差，電泳/熒光實時監(jiān)控擴增。
質(zhì)控品設(shè)置
每批次包含陰/陽性質(zhì)控（傳染性支氣管炎病毒），驗證體系無污染且有效。
四 環(huán)境與設(shè)備
穩(wěn)定反應(yīng)條件
冰上配制反應(yīng)液提高特異性[2]，程序優(yōu)化變性/退火溫度。
PCR儀定期校準（如Q9604型號確保溫控精度）。
嚴格保存條件
多數(shù)試劑盒-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
總結(jié)
特殊領(lǐng)域通過靶標設(shè)計優(yōu)化+操作標準化+多重驗證+環(huán)境控制四重保障提升可靠性。例如支原體巢式PCR可檢出11種屬，qRT-PCR技術(shù)實現(xiàn)病毒準確定量。
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