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羅氏實時熒光定量PCR儀（LightCycler®系統(tǒng)）工作原理
實時熒光定量PCR（Quantitative PCR, qPCR）是一種結(jié)合PCR擴增和熒光檢測的技術，能夠?qū)NA或RNA進行精確定量。羅氏（Roche）的LightCycler®系列儀器（如LightCycler® 480）采用閉管檢測方式，通過監(jiān)測PCR過程中熒光信號的變化，實現(xiàn)核酸的實時定量分析。其核心工作原理可分為以下幾個部分：
1. PCR擴增與熒光檢測的結(jié)合
實時熒光定量PCR在傳統(tǒng)PCR的基礎上引入熒光標記探針或染料，使擴增過程可以被實時監(jiān)測。羅氏LightCycler®系統(tǒng)的主要檢測方式包括：
(1) 基于熒光探針的檢測（如TaqMan探針）
探針結(jié)構：
探針兩端分別標記熒光報告基團（如FAM）和淬滅基團（如TAMRA或BHQ）。
探針與目標DNA序列互補結(jié)合。
工作原理：
在PCR延伸階段，Taq DNA酶發(fā)揮5'→3'外切酶活性，切割探針，使報告基團與淬滅基團分離。
報告基團釋放熒光信號，其強度與PCR產(chǎn)物量成正比。
(2) 基于DNA結(jié)合染料的檢測（如SYBR Green）
染料特性：SYBR Green可非特異性地結(jié)合雙鏈DNA，并在激發(fā)后發(fā)出熒光。
檢測方式：
每輪PCR循環(huán)后，檢測熒光強度，反映雙鏈DNA的累積量。
需配合熔解曲線分析（Melting Curve Analysis）驗證擴增特異性。
2. 光學檢測系統(tǒng)
羅氏LightCycler®儀器采用多通道熒光檢測，主要流程如下：
激發(fā)光源：LED或鹵素燈提供特定波長的激發(fā)光（如470nm、530nm等）。
熒光采集：
光學傳感器在每輪PCR循環(huán)后掃描各孔熒光信號。
支持多重檢測（如FAM、HEX、ROX、Cy5等不同熒光通道）。
信號處理：
軟件記錄熒光強度變化，生成擴增曲線（Amplification Plot）。
3. 定量分析原理
(1) 閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）
Ct值（Threshold Cycle）：熒光信號達到設定閾值所需的PCR循環(huán)數(shù)。
定量依據(jù)：
初始模板量越高，Ct值越??；反之，Ct值越大。
通過標準曲線法（絕對定量）或ΔΔCt法（相對定量）計算目標核酸濃度。
(2) 標準曲線法（絕對定量）
使用已知濃度的標準品（如質(zhì)粒DNA）進行梯度稀釋并擴增。
繪制Ct值-log(起始拷貝數(shù))標準曲線。
根據(jù)待測樣本的Ct值，計算其初始模板量。
(3) 熔解曲線分析（特異性驗證）
適用情況：使用SYBR Green等非特異性染料時。
原理：
PCR結(jié)束后，緩慢升溫（如60°C→95°C），使雙鏈DNA解鏈。
監(jiān)測熒光信號隨溫度的變化，生成熔解曲線。
單一峰表示特異性擴增；多峰提示引物二聚體或非特異性產(chǎn)物。
4. 羅氏LightCycler®系統(tǒng)的技術特點
快速溫控：
采用Peltier半導體技術，升降溫速率可達4.8°C/秒，縮短實驗時間。
多重檢測能力：
支持4–6色熒光通道，可同時檢測多個靶標（如病原體分型）。
閉管操作：
減少開蓋污染風險，提高檢測穩(wěn)定性。
5. 應用示例
病毒載量檢測（如HIV、HBV）：通過Ct值定量病毒RNA/DNA。
基因表達分析（qRT-PCR）：比較不同樣本中mRNA的相對表達量。
突變檢測：結(jié)合高分辨率熔解曲線（HRM）分析SNP或點突變。
6. 注意事項
引物/探針設計：需確保特異性，避免交叉反應。
防污染措施：使用UNG酶（尿嘧啶-DNA糖基化酶）降解殘留PCR產(chǎn)物。
儀器校準：定期進行光學校準和溫度驗證，保證數(shù)據(jù)準確性。
總結(jié)
羅氏實時熒光定量PCR儀通過熒光標記探針或染料實時監(jiān)測PCR擴增，結(jié)合多通道光學檢測和Ct值分析，實現(xiàn)核酸的精確定量。其核心技術優(yōu)勢在于快速溫控、多重檢測和閉管操作，適用于臨床診斷、科研及工業(yè)檢測等領域。實驗成功的關鍵在于優(yōu)化反應體系、規(guī)范操作流程并定期維護儀器。
