超氧陰離子(Oxygen free radical, OFR)試劑盒說明書

微量法 100T/96S

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

生物體內(nèi)超氧陰離子等活性氧具有免疫和信號傳導(dǎo)的作用，但積累過多時會對細(xì)胞膜及生物大分子產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞和組織代謝異常，從而引起多種疾病。

測定原理：

超氧陰離子與鹽酸羥胺反應(yīng)生成 NO2^-，NO2^-在對氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成紅色的偶氮化 合物，在 530nm 處有特征吸收峰，根據(jù)ΔA 值可以計算樣品中 O2－含量，反應(yīng)式為 NH2OH + 2O2^- ＋H ^＋ → NO2^-＋ H2O2 ＋ H2O。

超氧陰離子試劑盒   氧化系列-常備現(xiàn)貨

試劑組成和配制：

自備儀器和用品：

天平、水浴鍋、離心機(jī)、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、氯仿和蒸餾水。

超氧陰離子提取：

1、植物、動物組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后，10000g，4℃，離心 20min，取上清置于冰上待測。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 10000g， 4℃，離心 20min，取上清置于冰上待測。

3、血清或培養(yǎng)液：直接測定。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 530nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表

混勻，37℃水浴 20min

混勻，37℃水浴 20min

超氧陰離子含量計算公式：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0242x - 0.0027，R²=0.9980

1. 組織：

（1） 按照樣本質(zhì)量計算

超氧陰離子含量（nmol/g 鮮重）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)×2

=148.76×(ΔA+0.0027)÷W

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ g·min）=148.76×(ΔA+0.0027)÷W÷T

=7.44× (ΔA+0.0027)÷W

（2） 按照蛋白質(zhì)濃度計算

超氧陰離子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反總÷(V 樣×Cpr)×2

=148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ mg prot·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr÷T

=7.44× (ΔA+0.0027)÷Cpr

2. 細(xì)菌，真菌：

超氧陰離子含量（nmol/10⁴ cell）= (ΔA+0.0027)÷0.0242× V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)×2

= 148.76×(ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/10⁴ cell·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量÷T

=7.44× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

3. 血清或培養(yǎng)液

超氧陰離子 含量（nmol/ml）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反總÷V 樣×2

=148.76× (ΔA+0.0027)

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ml·min）= 148.76× (ΔA+0.0027) ÷T

= 7.44× (ΔA+0.0027)

V 樣總：加入提取液體積，1 ml； V 反總：反應(yīng)總體積，0.36ml；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.2ml； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，20min；2: 2 分子O2－參與反應(yīng)生成 1分子NO2－。

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0121x - 0.0027，R² = 0.9980

1. 組織：

（1） 按照樣本質(zhì)量計算

超氧陰離子含量（nmol/g 鮮重）= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)×2

=297.52× (ΔA+0.0027)÷W

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ g·min）=297.52× (ΔA+0.0027)÷W÷T

=14.88× (ΔA+0.0027)÷W

（2） 按照蛋白質(zhì)濃度計算

超氧陰離子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V 反總÷(V 樣×Cpr)×2

=297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ mg prot·min）= 297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr÷T

=14.88× (ΔA+0.0027)÷Cpr

2. 細(xì)菌，真菌：

超氧陰離子含量（nmol/10⁴ cell）=(ΔA+0.0027)÷0.0121× V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)×2

=297.52× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/10⁴ cell·min）=297.52× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量÷T

=14.88× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

3. 血清或培養(yǎng)液

超氧陰離子 含量（nmol/ml）=(ΔA+0.0027)÷0.0121 ×V 反總÷V 樣×2

=297.52×(ΔA+0.0027)

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ml·min）= 297.52×(ΔA+0.0027) ÷T

=14.88×(ΔA+0.0027)

V 樣總：加入提取液體積，1 ml； V 反總：反應(yīng)總體積，0.36ml；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.2ml； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，20min；2：2 分子O2－參與反應(yīng)生成 1分子NO2－。

注意事項：

1、OD 值大于 1，樣品適當(dāng)稀釋再測定，注意計算公式里乘以稀釋倍數(shù)。

2、樣品制備好后，立刻進(jìn)行測定，請勿將樣品進(jìn)行長時間的低溫保存，以免影響測定結(jié)果。

3、試劑四有一定的毒性，請操作時做好防護(hù)措施。

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