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在細(xì)胞生物學(xué)研究中，對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記和染色是觀察細(xì)胞生理狀態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞活性以及分析細(xì)胞群體中活死細(xì)胞比例的重要手段。Calcein AM作為一種低細(xì)胞毒性的熒光染料，為這些研究提供了一種高效且可靠的解決方案。

一、Calcein AM 的熒光特性與工作原理

Calcein AM是一種常用的活細(xì)胞熒光標(biāo)記試劑，其激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為515 nm，屬于綠色熒光范圍。該染料能夠穿透活細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，在細(xì)胞內(nèi)由酯酶剪切，轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)綠色熒光的Calcein。Calcein由于其極性增強(qiáng)而被滯留在細(xì)胞質(zhì)中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞的標(biāo)記。Calcein AM的這一特性使其成為細(xì)胞活性檢測(cè)的理想選擇，因?yàn)樗茉诓挥绊懠?xì)胞正常生理功能的前提下，對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。

在細(xì)胞膜完整性的活細(xì)胞中，Calcein AM的細(xì)胞毒性很低，不會(huì)干擾細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)。這使得Calcein AM不僅可以用于短期的細(xì)胞觀察，還適用于長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。Calcein AM的熒光信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)的酯酶活性相關(guān)，因此也可以間接反映細(xì)胞的代謝狀態(tài)和活性水平。在細(xì)胞凋亡或壞死過(guò)程中，細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，Calcein AM無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)的酯酶活性降低，導(dǎo)致熒光信號(hào)減弱或消失，這為檢測(cè)細(xì)胞活力和篩選具有細(xì)胞毒性化合物提供了便利。

二、Calcein AM 與 PI 雙重染色的解決方案

Calcein AM常與PI（碘化丙啶）結(jié)合使用，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色。PI是一種核酸染料，不能穿透活細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，但能與死細(xì)胞或細(xì)胞膜受損的細(xì)胞中的DNA結(jié)合，發(fā)出紅色熒光。Calcein AM標(biāo)記活細(xì)胞產(chǎn)生綠色熒光，PI標(biāo)記死細(xì)胞產(chǎn)生紅色熒光，二者結(jié)合使用可以在熒光顯微鏡下清晰地鑒別和定量分析活細(xì)胞與死細(xì)胞的比例。

在進(jìn)行雙重染色時(shí)，首先將Calcein AM和PI分別加入細(xì)胞培養(yǎng)體系中，按照各自的推薦濃度進(jìn)行孵育。Calcein AM通常的使用濃度為1 - 10 μM，PI的使用濃度一般為1 - 10 μg/mL。孵育時(shí)間一般為15 - 30分鐘，具體時(shí)間需根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行優(yōu)化。孵育完成后，使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞顯示綠色熒光，死細(xì)胞顯示紅色熒光；在流式細(xì)胞儀中，可以通過(guò)設(shè)置相應(yīng)的熒光檢測(cè)通道，分別收集綠色和紅色熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞的定量分析。這種雙重染色方法廣泛應(yīng)用于細(xì)胞毒性檢測(cè)、藥物篩選、細(xì)胞生物學(xué)研究等領(lǐng)域。通過(guò)精確分析活死細(xì)胞比例，研究人員可以評(píng)估化合物的細(xì)胞毒性、細(xì)胞培養(yǎng)的狀態(tài)以及細(xì)胞對(duì)各種刺激的響應(yīng)。

三、Calcein AM 的操作使用方法

染色前準(zhǔn)備

在進(jìn)行Calcein AM染色之前，需要準(zhǔn)備好細(xì)胞樣本。對(duì)于貼壁細(xì)胞，可以使用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，然后用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌細(xì)胞，去除殘留的培養(yǎng)基成分。對(duì)于懸浮細(xì)胞，直接收集細(xì)胞并進(jìn)行洗滌。將細(xì)胞調(diào)整到合適的濃度，一般為1×10^5 - 1×10^6 cells/mL，以便于后續(xù)的染色和檢測(cè)。

染色過(guò)程

將準(zhǔn)備好的細(xì)胞與Calcein AM染色液混合，Calcein AM的常用工作濃度為1 - 10 μM。將混合后的細(xì)胞懸液置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育15 - 30分鐘。在孵育過(guò)程中，Calcein AM會(huì)穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切轉(zhuǎn)化為Calcein，產(chǎn)生綠色熒光。

染色后處理

孵育完成后，對(duì)于某些實(shí)驗(yàn)，可能需要去除未進(jìn)入細(xì)胞的Calcein AM，以減少背景熒光。可以使用適當(dāng)?shù)木彌_液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌，但需注意操作輕柔，避免細(xì)胞損失。將處理后的細(xì)胞懸液或細(xì)胞涂片置于熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞會(huì)發(fā)出明亮的綠色熒光，細(xì)胞質(zhì)中均勻分布著熒光信號(hào)。對(duì)于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，將染色后的細(xì)胞懸浮在適當(dāng)?shù)木彌_液中，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，通過(guò)設(shè)置488 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和515 nm左右的發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)通道，收集綠色熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞的定量分析。

四、Calcein AM 的應(yīng)用案例與研究成果

Calcein AM已被廣泛應(yīng)用于多種研究領(lǐng)域。在細(xì)胞毒性檢測(cè)中，科研人員利用Calcein AM與PI雙重染色，結(jié)合流式細(xì)胞儀分析，評(píng)估了多種化合物對(duì)細(xì)胞的毒性作用，為藥物研發(fā)和毒性篩選提供了重要數(shù)據(jù)支持。在細(xì)胞生物學(xué)研究中，Calcein AM用于標(biāo)記活細(xì)胞，觀察細(xì)胞的遷移、增殖和代謝活動(dòng)，揭示細(xì)胞在不同生理?xiàng)l件下的行為和機(jī)制。在細(xì)胞治療研究中，Calcein AM用于標(biāo)記治療性細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞在體內(nèi)的存活和分布情況，優(yōu)化細(xì)胞治療方案。

此外，Calcein AM還被用于細(xì)胞凋亡研究。在凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，Calcein AM可以顯示細(xì)胞在凋亡過(guò)程中的熒光變化，幫助研究人員分析凋亡誘導(dǎo)劑的效果和凋亡發(fā)生的動(dòng)力學(xué)特征。