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一個(gè)月 |
應(yīng)用領(lǐng)域 |
化工 |
Glycated hemoglobin A1c ELISA KIT（ELISA試劑盒）樣品收集、處理及保存方法：血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。檢測(cè)對(duì)象:人血清/血漿及相關(guān)液體實(shí)驗(yàn)方法:雙抗原夾心法進(jìn)行測(cè)
Glycated hemoglobin A1c ELISA KIT（ELISA試劑盒）
Glycated hemoglobin A1c ELISA KIT 即糖化血紅蛋白 A1c 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，以下是關(guān)于它的詳細(xì)介紹：
雙抗體夾心法：以兔糖化血紅蛋白 A1c ELISA 試劑盒為例，用純化的糖化血紅蛋白 A1c 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入糖化血紅蛋白 A1c，再與 HRP 標(biāo)記的糖化血紅蛋白 A1c 抗體結(jié)合，形成抗體 - 抗原 - 酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過che底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的糖化血紅蛋白 A1c 呈正相關(guān)，用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測(cè)定吸光度（OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中糖化血紅蛋白 A1c 濃度。
競(jìng)爭(zhēng)法：如 Abbexa 公司的人糖化血紅蛋白 A1c ELISA 試劑盒，是基于競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)。先將抗體預(yù)包被到 96 孔板上，加入標(biāo)準(zhǔn)品、測(cè)試樣品和生*素標(biāo)記的試劑，生*素標(biāo)記的糖化血紅蛋白 A1c 和未標(biāo)記的糖化血紅蛋白 A1c 會(huì)在包被抗體上發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)，再加入 HRP 標(biāo)記的試劑，孵育后洗去未結(jié)合的結(jié)合物，加入 TMB 底物進(jìn)行顯色，顏色變化與糖化血紅蛋白 A1c 的量成反比，通過測(cè)定 OD 值計(jì)算糖化血紅蛋白 A1c 的濃度。
酶標(biāo)包被板：通常為 96 孔或 48 孔板，表面預(yù)包被有特異性抗體。
標(biāo)準(zhǔn)品：已知濃度的糖化血紅蛋白 A1c，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便根據(jù)樣品的吸光度值計(jì)算其濃度。
酶標(biāo)試劑：一般為 HRP 標(biāo)記的抗體或其他酶標(biāo)記的試劑，用于與抗原或抗體結(jié)合，產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。
顯色劑：如 TMB 底物，在酶的作用下發(fā)生顏色變化，用于指示反應(yīng)的結(jié)果。
終止液：用于終止顯色反應(yīng)，使顏色穩(wěn)定，便于測(cè)量吸光度。
洗滌液：用于洗滌反應(yīng)板，去除未結(jié)合的物質(zhì)，減少非特異性結(jié)合的干擾。
樣品稀釋液：用于稀釋樣品，使樣品中的糖化血紅蛋白 A1c 濃度在試劑盒的檢測(cè)范圍內(nèi)。
以常見的雙抗體夾心法為例：
試劑準(zhǔn)備：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，在室溫平衡 15-30 分鐘。按照說明書要求稀釋洗滌液、配制酶標(biāo)工作液等。
加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上準(zhǔn)確加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育一定時(shí)間，使抗原與抗體充分結(jié)合。
洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復(fù)多次，拍干，以去除未結(jié)合的物質(zhì)。
加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑，空白孔除外，然后進(jìn)行溫育。
顯色：每孔先加入顯色劑 A，再加入顯色劑 B，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色一定時(shí)間。
終止：每孔加終止液，終止反應(yīng)，此時(shí)顏色會(huì)發(fā)生變化，如藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。
測(cè)定：以空白孔調(diào)零，在 450nm 波長下依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值），并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中糖化血紅蛋白 A1c 的濃度。
試劑盒保存：應(yīng)按照說明書要求在 2-8℃條件下保存，避免冷凍和反復(fù)凍融，有效期一般為 6 個(gè)月左右。
操作規(guī)范：嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育，所有試劑在使用前需達(dá)到室溫 20-25℃。加樣要準(zhǔn)確，使用加樣器并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，一次加樣時(shí)間最好控制在 5 分鐘內(nèi)。
避免污染：操作過程中要注意防止交叉污染，封板膜只限一次性使用，不同批號(hào)的試劑組分不得混用。
底物保存：底物顯色液應(yīng)避光保存，如發(fā)現(xiàn)底物液已經(jīng)變藍(lán)則不能使用。
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