HRP分子中與酶活性無(wú)關(guān)的糖基被過(guò)碘酸鈉氧化為醛基,再與抗體蛋白的氨基形成Schiff堿。為了防止酶蛋白的氨基與醛基發(fā)生自身偶聯(lián),在標(biāo)記前先用2,4-二硝基氟苯(DNFB)封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基。酶與抗體的結(jié)合反應(yīng)后,再加入硼氫化鈉還原成穩(wěn)定的結(jié)合物。
(1) 取HRP 5mg溶于0.2mol/L,pH5.6醋酸鹽緩沖液1ml中,加入1%DNFB無(wú)水乙醇溶液0.1ml,室溫下輕微攪拌1h;
(2) 加入新鮮配置的0.1mol/L NaIO4 0.5ml,此時(shí)溶液由原棕色變?yōu)槟G色,置4℃放置30min,此時(shí)溶液由原棕色變?yōu)槟G色;
(3) 加入2.5%乙二醇1ml, 室溫下輕微攪拌1h,終止反應(yīng);
(4) 加入待標(biāo)記的抗體5-10mg, 用1.0mol/L, pH9.5 CBS,調(diào)節(jié)pH值至9.0;
(5) 混勻,置4℃改良過(guò)碘酸鈉標(biāo)記法制備酶標(biāo)抗體
(6) 加入硼氫化鈉溶液0.1ml,混勻,4℃放置3h;
(7) 對(duì)0.01mol/L,pH7.4 PBS,4℃透析,換液3次;
(8) 3000r/min離心30min,去除沉淀物;
(9) 收集上清液即為酶標(biāo)記抗體。
【注意事項(xiàng)】
(1) 在氧化HRP時(shí),以pH5.6醋酸鹽緩沖液溶解酶為宜。
(2) 一般認(rèn)為氧化HRP 5mg, NaIO4量以0.06mol/L 0.5ml為宜,不能低于0.015mol/L 0.5ml。
(3) 氧化HRP時(shí)間以15-30min為宜。
(4) 加入DNFB的目的是為了封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基。
(5) 加入乙二醇的目的是終止反應(yīng);為便于在加入抗體后調(diào)pH值,故乙二醇要用0.05mol/L CBS配制。
改良過(guò)碘酸鈉標(biāo)記法制備酶標(biāo)抗體
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來(lái)源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來(lái)源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來(lái)源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé),不承擔(dān)此類(lèi)作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí),必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來(lái)源,并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問(wèn)題,請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。