同類(lèi)產(chǎn)品
乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)試劑盒說(shuō)明書(shū)
分光光度法 50 管/24 樣
測(cè)定意義:
LDH(EC 1.1.1.27)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是糖酵解途徑的末端酶,催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng),伴隨著 NAD+/NADH 之間互變。
測(cè)定原理:
LDH 催化 NAD+氧化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸進(jìn)一步與 2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙,在堿性溶液中顯棕紅色,顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。
需自備的儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:30mL×1 瓶, 4℃保存;試劑一:液體 15 mL×1 瓶, 4℃保存;
試劑二:粉劑×1 支,-20℃保存,用時(shí)加入 1.3 mL 蒸餾水充分溶解備用,配好后-20 ℃保存,可保存兩周,禁止反復(fù)凍融;試劑三:液體 15 mL×1 瓶,4℃保存;
試劑四:液體 50 mL×1 瓶,4℃保存;
樣品測(cè)定的準(zhǔn)備:
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次); 8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱(chēng)取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 450nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定(在 EP 管中加入下列試劑)
試劑名稱(chēng)(μL) | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
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樣本 | 50 | 50 |
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試劑一 | 250 | 250 |
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試劑二 | 50 |
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蒸餾水 |
| 50 |
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充分混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)水浴 15min | ||
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試劑三 | 250 | 250 |
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充分混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)水浴 15min
試劑四 750 750
充分混勻,室溫靜置 3 分鐘,450 nm 下測(cè)定吸光度,計(jì)算ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
LDH 活力單位的計(jì)算:
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線(xiàn), y = 0.725x (x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,umol/mL;y 為對(duì)吸光度)。2、血清(漿)LDH 活力的計(jì)算單位的定義:每 mL 血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
LDH(U/mL)=ΔA÷0.725÷T×103=92×ΔA
3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中 LDH 活力的計(jì)算(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
LDH(U/mg prot)=[ΔA÷0.725×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =92×ΔA÷Cpr
需要另外測(cè)定,建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。(2) 按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
LDH(U/g 鮮重)=[ΔA÷0.725×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =92×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
LDH(U/104 cell)= [ΔA÷0.725×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103 =0.184×ΔA÷W
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.05mL;V2:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,15 min;Cpr:蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)。
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