乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/24 樣

測(cè)定意義：

LDH（EC 1.1.1.27）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)，伴隨著 NAD+/NADH 之間互變。

測(cè)定原理：

LDH 催化 NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步與 2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：30mL×1 瓶， 4℃保存；試劑一：液體 15 mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存，用時(shí)加入 1.3 mL 蒸餾水充分溶解備用，配好后-20 ℃保存，可保存兩周，禁止反復(fù)凍融；試劑三：液體 15 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑四：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存；

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 450nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定（在 EP 管中加入下列試劑）

充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 15min

試劑四                      750                         750

充分混勻，室溫靜置 3 分鐘，450 nm 下測(cè)定吸光度，計(jì)算ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

LDH 活力單位的計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線(xiàn)， y = 0.725x (x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，umol/mL；y 為對(duì)吸光度)。2、血清（漿）LDH 活力的計(jì)算單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（U/mL）=ΔA÷0.725÷T×10³=92×ΔA

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中 LDH 活力的計(jì)算（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（U/mg prot）=[ΔA÷0.725×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ =92×ΔA÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（U/g 鮮重）=[ΔA÷0.725×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ =92×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（U/10⁴ cell）= [ΔA÷0.725×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×10³ =0.184×ΔA÷W

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。