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NAD 激酶(NAD kinase, NADK)試劑盒說明書

來源:青島捷世康生物科技有限公司   2016年10月12日 10:34  

NAD 激酶(NAD kinase, NADK)試劑盒說明書

 

分光光度法 50 管/48 樣

測定意義:

NADKEC 2.7.1.23)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是目前所發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)惟一能夠催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶,可催化 NAD(H)ATP 或無機(jī)多聚磷酸

[poly(P)]作為磷?;w進(jìn)行磷酸化反應(yīng),生成 NADP(H)。因此,NAD 激酶在合成 NADP(H)

以及調(diào)節(jié) NAD(H)NADP(H)的平衡上具有重要作用。

測定原理:

NADK 催化 NAD+磷酸化,生成 NADP+NADP+可被 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為 NADPH; NADPH 通過 PMS 的遞氫作用,還原氧化型噻唑藍(lán)(MTT),通過在 600 nm 下測定 MTT 的還原速度(吸光值的變化)可反映出 NADK 活性的大小。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

提取液:液體 50 mL×1 瓶,4℃保存;試劑一:液體 20 mL×1 瓶,4℃保存;試劑二:液體 50 mL×1 瓶,4℃保存;試劑三:粉劑×1 瓶,-20 ℃保存;試劑四:粉劑×1 瓶,-20℃保存;試劑五:粉劑×1 瓶, -20℃保存;

樣本測定的準(zhǔn)備:

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~10001 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次); 8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

 

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。2、血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟:

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 600nm,蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑一和試劑二 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)水浴 15min 以上。

3、工作液的配制:在試劑三中加入 16mL 試劑一,充分混勻待用。工作液的配制:在試劑四中加入 22mL 試劑二,充分混勻待用。工作液的配制:在試劑五中加入 22mL 試劑二,充分混勻待用。

 

4、加樣表

 

試劑名稱(μL)

測定孔

 

 

樣本

80

 

 

工作液

320

 

 

充分混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)水浴 15min,立即煮沸2min(蓋緊,防止水分散失)冰浴冷卻,10000g,室溫離心 10min,取上清

上清液

100

 

 

工作液

440

 

 

工作液

440

 

 

加完試劑混勻后立即在 600nm 下測定 30 秒的吸光值 A1 和 3 分鐘 30 秒時(shí)的吸光值 A2,計(jì)算A= A2-A1

NADK 活性計(jì)算:

1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADKU/mg prot=[406×A - 0.004×V1]÷V1×Cpr÷T=135.3×A - 0.004÷Cpr

需要另外測定,建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。(2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADKU/g 鮮重)=[406×A - 0.004×V1]÷(W×V1÷V2÷T =135.3×A - 0.004÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位的定義:每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADKU/104 cell=[406×A - 0.004×V1]÷500×V1÷V2÷T =0.271×A - 0.004V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.08mL;V2:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,3min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL W:樣本質(zhì)量,g;;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。

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