NAD 激酶（NAD kinase, NADK）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

測定意義：

NADK（EC 2.7.1.23）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是目前所發(fā)現(xiàn)的生物體內惟一能夠催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶，可催化 NAD(H)以 ATP 或無機多聚磷酸

[poly(P)]作為磷?；w進行磷酸化反應，生成 NADP(H)。因此，NAD 激酶在合成 NADP(H)

以及調節(jié) NAD(H)與 NADP(H)的平衡上具有重要作用。

測定原理：

NADK 催化 NAD⁺磷酸化，生成 NADP⁺；NADP⁺可被 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為 NADPH； NADPH 通過 PMS 的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍（MTT），通過在 600 nm 下測定 MTT 的還原速度（吸光值的變化）可反映出 NADK 活性的大小。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存；試劑一：液體 20 mL×1 瓶，4℃保存；試劑二：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存；試劑三：粉劑×1 瓶，-20 ℃保存；試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存；試劑五：粉劑×1 瓶, -20℃保存；

樣本測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 600nm，蒸餾水調零。

2、將試劑一和試劑二 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 15min 以上。

3、工作液Ⅰ的配制：在試劑三中加入 16mL 試劑一，充分混勻待用。工作液Ⅱ的配制：在試劑四中加入 22mL 試劑二，充分混勻待用。工作液Ⅲ的配制：在試劑五中加入 22mL 試劑二，充分混勻待用。

4、加樣表

充分混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 15min，立即煮沸2min（蓋緊，防止水分散失）冰浴冷卻，10000g，室溫離心 10min，取上清

加完試劑混勻后立即在 600nm 下測定 30 秒的吸光值 A1 和 3 分鐘 30 秒時的吸光值 A2，計算△A= A2-A1

NADK 活性計算：

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADP 定義為一個酶活力單位。

NADK（U/mg prot）=[406×（△A - 0.004）×V1]÷（V1×Cpr）÷T=135.3×（△A - 0.004）÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADP 定義為一個酶活力單位。

NADK（U/g 鮮重）=[406×（△A - 0.004）×V1]÷(W×V1÷V2）÷T =135.3×（△A - 0.004）÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADP 定義為一個酶活力單位。

NADK（U/10⁴ cell）=[406×（△A - 0.004）×V1]÷（500×V1÷V2）÷T =0.271×（△A - 0.004）V1：加入反應體系中樣本體積，0.08mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，3min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL； W：樣本質量，g;；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬。