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基因組DNA提取常見問題分析
| 常見問題 | 可能原因 | 建議解決方案 |
| 洗脫產(chǎn)物的DNA量很少或沒有 | 所提樣品材料老化或反復(fù)凍融導(dǎo)致基因組DNA含量下降 | 應(yīng)選擇新鮮的樣品材料，如新鮮血液、新鮮菌液、剛離體的動物組織或幼嫩的植物組織等，不能即時處理的樣品應(yīng)立即放入液氮或-70℃低溫保存，以免DNA降解。 |
| 樣品破壁或裂解不*導(dǎo)致基因組DNA未充分釋放 | 動、植物材料應(yīng)在液氮中充分研磨勻漿，G+細(xì)菌、酵母等破壁較困難的樣品應(yīng)用溶菌酶、酵母破壁酶或機(jī)械方式協(xié)助破壁，不同樣品的細(xì)胞破壁方式可參照前面的詳細(xì)介紹。 | |
| 樣品量過多導(dǎo)致細(xì)胞裂解不充分 | 加樣量過多使裂解液和樣品混合不均勻，細(xì)胞裂解不充分。不同來源樣品的加樣量請參照詳細(xì)操作步驟。 | |
| DNA吸附不充分 | 如在上吸附柱前末加無水乙醇，或用低濃度乙醇代替無水乙醇，則導(dǎo)致DNA不能充分沉淀，與硅膠膜吸附不*，因此應(yīng)在樣品裂解后加適量無水乙醇，再上吸附柱使DNA與硅膠膜充分吸附。 | |
| DNA洗脫不適當(dāng) | 洗脫液pH值過低會降低洗脫效率，應(yīng)確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間；洗脫體積若小于30μ，則不易*浸透硅膠膜，使DNA不能全部洗脫下來，因此洗脫液體積應(yīng)大于30 μl，同時如洗脫液體積過大，超過200μl，則所得的DNA濃度會降低，但DNA總量不會減少；洗脫時可將洗脫緩沖液在65-70℃水浴預(yù)熱，加入洗脫液后在室溫靜置2-5分鐘，可提高洗脫效率，提高基因組DNA的產(chǎn)量。 | |
| 提取的基因組DNA有降解 | 選取的材料不新鮮或反復(fù)凍融，采集材料后未及時處理或末低溫保存 | 陳舊血液、老化菌液等不新鮮的材料中，細(xì)胞凋亡導(dǎo)致DNA降解，或低溫保存的樣品反復(fù)凍融導(dǎo)致細(xì)胞破碎，內(nèi)源核酸酶降解DNA，因此應(yīng)選擇新鮮的材料樣品，不能及時處理則低溫保存，運(yùn)輸過程中亦應(yīng)使用干冰。 |
| 未能有效抑制內(nèi)源核酸酶作用 | 某些DNase含量較豐富的動、植物組織樣品應(yīng)在液氮中研磨或勻漿，研磨過程中應(yīng)隨時補(bǔ)充液氮，并在樣品末*解凍前即加入含有抑制核酸酶作用的鰲合劑的裂解液。 | |
| 操作過于劇烈導(dǎo)致DNA被機(jī)打斷 | 預(yù)處理的樣品加入細(xì)胞裂解液后，所有操作應(yīng)盡量柔和，避免振蕩、攪拌等劇烈機(jī)械力對DNA片段的損傷。 | |
| 提取的基因組DNA中有RNA污染 | 實(shí)驗過程中沒有有效使用RNase A | 應(yīng)嚴(yán)格按照實(shí)驗操作要求使用，即加入裂解液的同時加入20μl RNase A溶液，室溫放置10分鐘。 |
| RNAase A可能失活 | RNase A須在-20℃下保存，低溫保存時RNase A比較穩(wěn)定，不易失活，但如果反復(fù)凍融會導(dǎo)致RNase A降解失活，所以應(yīng)妥善保存。 | |
| 提取的基因組DNA不能順利地進(jìn)行后續(xù)試驗 | 樣品量過多導(dǎo)致細(xì)胞裂解不充分 | 樣品量過多會使裂解液不能快速有效地與樣品充分混合，從而導(dǎo)致樣品裂解不*，殘留大量蛋自、多糖、脂類等雜質(zhì)，為后續(xù)的上吸附柱分離純化造成影響。應(yīng)加入適當(dāng)量的樣品材料，具體數(shù)量請參照詳細(xì)操作步驟。 |
| DNA在洗脫前有大量乙醇?xì)埩?/div> | 有機(jī)溶劑乙醇可嚴(yán)重抑制內(nèi)切酶、DNA聚合酶的活性，而在DNA過柱洗滌過程中需使用含有乙醇的漂洗液，因此在洗脫DNA前，—定要充分去除殘留的乙醇，可重復(fù)離心，或?qū)⑽街糜谑覝鼗?0℃溫箱中烘干5-10分鐘，再加洗脫液。 |
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