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DNA產(chǎn)物純化常見問題分析
| 常見問題 | 可能原因 | 建議解決方案 |
| 未回收或回收率低 | 膠塊未全部溶解 | 溶解凝膠時應(yīng)該置于65℃水浴，不斷上下顛倒，確定膠塊*溶解后再進行下一步操作。如果凝膠濃度較大，可增加溶膠液使用量。 |
| 膠塊太大（>400mg） | 如果需要處理的膠塊太大，應(yīng)該先將其切成小塊，做兩次回收或選用大量型回收試劑盒。 | |
| 電泳緩沖液pH過高 | 硅膠膜在高鹽低pH值時可結(jié)合DNA，在低鹽高pH值條件下洗脫。如果電泳緩沖液pH值太高，會導(dǎo)致DNA無法結(jié)合或降低結(jié)合率，可在溶膠后加入3M NaAc （pH5.2），將pH值調(diào)至7.0以下。 | |
| 漂洗液中未加入無水乙醇 | *次使用之前應(yīng)該在漂洗液中加入無水乙醇。漂洗液每次用后應(yīng)該擰緊瓶蓋，以免乙醇揮發(fā)，降低回收率。 | |
| 洗脫液不合適 | DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如TE和水；洗脫液pH值過低會降低洗脫效率，應(yīng)確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間，當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內(nèi)；洗脫時可將洗脫緩沖液在65-70℃水浴預(yù)熱，加入洗脫液后在室溫靜置2-5分鐘，可提高洗脫效率。 | |
| 洗脫液加入位置不正確 | 洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位，確保洗脫液能*覆蓋硅膠膜的表面以達到大洗脫效率。 | |
| 洗脫體積太小 | 洗脫液體積若小于30μl，則不易*浸透硅膠膜，使洗脫效率降低；洗脫液體積若超過200μl，則所得的DNA濃度會降低，但DNA總量不會減少。為了得到較高的洗脫效率可以適當增大洗脫液體積。 | |
| 洗脫時間過短 | 洗脫時間對回收率也會有—定影響，洗脫時放置2分鐘可達到較好的效果。 | |
| 回收后的片斷無法用于后續(xù)試驗，如連接等 | 乙醇殘留 | 洗脫時硅膠膜上有漂洗緩沖液殘留，會使洗脫產(chǎn)物中含乙醇，影響下游操作，在洗脫之前可通過再次離心或置于50℃烤箱中5-10分鐘，*去除漂洗緩沖液中的乙醇。 |
| 洗出液中污染有瓊脂糖 | 凝膠未全部溶解 | |
| 洗脫產(chǎn)物有ssDNA，表現(xiàn)為在瓊脂糖電泳上呈現(xiàn)小的彌散帶。 | 將洗脫產(chǎn)物95℃加熱2分鐘，慢慢冷卻到室溫，使單鏈DNA重新退火復(fù)性即可。 |
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