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傳代細(xì)胞培養(yǎng)

來源:蒂科(上海)生物科技有限公司   2017年01月16日 13:28  

什么是傳代細(xì)胞培養(yǎng)?

原代細(xì)胞或細(xì)胞株或細(xì)胞系需在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代,以便獲得穩(wěn)定的原代細(xì)胞或細(xì)胞株或細(xì)胞系或得到大量的同種細(xì)胞,并維持細(xì)胞種的延續(xù),這個過程體外培養(yǎng)稱為傳代細(xì)胞培養(yǎng)。一般認(rèn)為,細(xì)胞培養(yǎng)形成單層匯合,細(xì)胞密度與生存空間有密切的關(guān)系,將培養(yǎng)細(xì)胞分散,以1:2或l:3或1:4以上的比率轉(zhuǎn)移分散進(jìn)行培養(yǎng),即為傳代細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞傳代后,一般經(jīng)過三個階段:游離期、指數(shù)增生期和停止期。

常用細(xì)胞分裂指數(shù)表示細(xì)胞增殖的旺盛程度,即細(xì)胞群的分裂相數(shù)/100個細(xì)胞。一般細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.2%~0.5%,腫瘤細(xì)胞可達(dá)3~5%。細(xì)胞接種2~3天分裂增殖旺盛,是活力時期,稱指數(shù)增生期(對數(shù)生長期),適宜進(jìn)行各種試驗。



一、傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

(1)吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基(以25mL培養(yǎng)瓶為例)。

(2)每瓶加入2mL,無鈣、鎂PBS,漂洗一次后倒掉。

(3)每瓶加入1mL消化液(0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液),輕輕搖動培養(yǎng)瓶,經(jīng)消化液鋪滿所有細(xì)胞表面,待細(xì)胞層略有松動,肉眼可觀察到“薄膜”現(xiàn)象時,倒掉消化液,再繼續(xù)作用2~3分鐘,輕輕搖動,細(xì)胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來,在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓,細(xì)胞間隙增大,此時應(yīng)立即終止消化。

(4)加入*培養(yǎng)基5mL,用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞,吹打時要按順序進(jìn)行,以確保所有瓶壁均吹打到,吹打時動作要輕柔,不要用力過大,盡可能不要出現(xiàn)泡沫,以避免細(xì)胞的機(jī)械損傷。

(5)用計數(shù)板計數(shù),計算細(xì)胞的濃度,并用培養(yǎng)基調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)。

二、傳代細(xì)胞的建系和維持

1、細(xì)胞檔案

細(xì)胞檔案要記錄好,如組織來源、生物學(xué)特性(由形態(tài)、生長繁殖曲線、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有無支原體和潛存病毒等)、培養(yǎng)基的要求、傳代換液時間、擴(kuò)增時間(分裂指數(shù)),細(xì)胞的特殊遺傳標(biāo)志(標(biāo)記染色體)等,這些記錄對于保證細(xì)胞的正常生長,保持細(xì)胞的一致和經(jīng)長期培養(yǎng)細(xì)胞特性的變異比較,都有十分重要的意義。

2、換液傳代

(1)細(xì)胞系的傳代、換液方法與前相同,但一般都有自身的規(guī)律性,因而在繼續(xù)傳代時,要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性,這樣可以減少由于傳代時細(xì)胞密度的頻繁增減或換液時間的不規(guī)律而導(dǎo)致細(xì)胞生長特性的改變,給以后的實驗帶來影響。

(2)多種細(xì)胞系維持傳代,要嚴(yán)格操作程序,對所用的試劑各系不能交叉。每傳5代后,細(xì)胞種子均應(yīng)凍存。傳代時均應(yīng)作好記錄,培養(yǎng)瓶上要有明顯標(biāo)記,標(biāo)記細(xì)胞系名稱和傳代的代數(shù)及傳代時間。細(xì)胞種子的及時凍存不僅可防止污染丟失,而且還可防止因盲目傳代而造成細(xì)胞變異,此外還可提供不同代次的細(xì)胞同時進(jìn)行對比試驗。

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