流式干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中熒光染料如何選擇

（1）確定熒光染料本身所適合的流式干細(xì)胞儀，需要了解染料的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)、儀器所配制的檢測(cè)濾光片和激發(fā)光源。

（2）了解熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度：相對(duì)熒光強(qiáng)度反映的是熒光素-單抗結(jié)合物的亮度，其判斷標(biāo)準(zhǔn)是染色指數(shù)。影響相對(duì)熒光強(qiáng)度的因素包括：不同儀器的激光及濾片組合不同，熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度不同；抗體上熒光素分子的多少會(huì)影響相對(duì)的熒光強(qiáng)度。

（3）選擇原則：考慮抗原的密度【高密度表達(dá)的抗原可考慮選擇幾乎所有的熒光素；低密度表達(dá)的抗原需要可提供較高S/N比值的熒光素，如PE/APC。】；自發(fā)熒光【每種干細(xì)胞群都有不同水平的自發(fā)熒光，所有的熒光通道均可觀察的自發(fā)熒光，但自發(fā)熒光強(qiáng)度在波長(zhǎng)較長(zhǎng)時(shí)迅速降低。對(duì)自發(fā)熒光較強(qiáng)的細(xì)胞，選擇發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)的熒光素（APC）可得到較好的S/N比值，對(duì)于自發(fā)熒光強(qiáng)度弱的細(xì)胞，發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)的熒光素對(duì)S/N提高沒(méi)有明顯的改善，可選用FITC?！?；非特異性結(jié)合；復(fù)合染料【避免信號(hào)衰退。復(fù)合染料因?yàn)楣?、固定劑或溫度升高?huì)導(dǎo)致信號(hào)衰退，使復(fù)合染料在上一級(jí)染料處發(fā)光。減少樣本暴露于光、高溫或固定劑，可很大程度上避免這一問(wèn)題。若樣本需要固定，要選擇穩(wěn)定的固定劑，可有效阻止復(fù)合染料的信號(hào)衰退。盡量減少信號(hào)間的干擾，檢測(cè)的顏色越多，面臨的信號(hào)干擾越多，選擇試劑時(shí)盡可能降低熒光發(fā)射波長(zhǎng)間的重疊。】。