人類體細胞染色體標本制備實驗原理和操作步驟

實驗原理 
染色體是在顯微鏡下可見原代細胞有絲分裂過程中出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。因此，必須獲得染色體標本才能進行檢查分析，通常情況下，都是利用外周血淋巴細胞進行核型分析。正常情況下，人體外周血淋巴細胞不再分裂，但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴細胞轉(zhuǎn)化成淋巴母細胞，使其恢復增殖能力。因此，可采取少量外周靜脈血，做短期培養(yǎng)，培養(yǎng)至72小時細胞進入增殖旺盛期，此時加入秋水仙素抑制細胞分裂，使細胞分裂停止在中期以獲得足夠量的分裂期細胞，經(jīng)低滲、固定、制片、染色后鏡下觀察進行核型分析。

實驗用品 
1．采血器材、酒精燈、培養(yǎng)瓶、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、離心機、刻度離心管、乳頭吸管、試管架、量筒、試劑瓶、載玻片、吹風機、托盤天平、顯微鏡、鏡油、二甲苯、擦鏡紙、鑷子、燒杯、記號筆、玻片架、火柴、10ml注射器。 
2．RPMI 1640液體培養(yǎng)基、小牛血清、肝素（500 U/ml）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（10mg/ml）、KCl低滲液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸緩沖液（PH6.8）。 
3．2.5％胰酶溶液（hanks液配制）、0.4％酚紅、Giemsa染色液、1N鹽酸。 

實驗步驟
一．外周血淋巴原代細胞染色體標本制備與分析 
1. 采血及接種培養(yǎng) 
1.1 在酒精燈火焰上，用滅菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml，使肝素濕潤至管壁。 
1.2 常規(guī)消毒后，采集外周靜脈血5ml，轉(zhuǎn)動注射器使血液與肝素混勻。 
1.3 在超凈工作臺中，預先將RPMI 1640液體培養(yǎng)基（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）加入消毒好的小培養(yǎng)瓶中，再滴加25滴全血（6號針頭），水平搖動混勻。 
1.4 置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)過程中每天水平搖動培養(yǎng)物1～2次，使血液均勻懸浮，再繼續(xù)培養(yǎng)。 
1.5 終止培養(yǎng)前2～4小時，加入秋水仙素，使終濃度達到0.2μg/ml。輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使秋水仙素混勻。繼續(xù)培養(yǎng)至72小時。 

2．制片 
2.1 收集細胞時，去掉瓶塞，用乳頭吸管吸取培養(yǎng)液，充分混勻培養(yǎng)物，再將全部培養(yǎng)物吸入刻度離心管中。 
2.2 1000 rpm離心8分鐘（注意先配平）。 
2.3 棄上清液，加入37℃預溫的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml，用吸管輕輕吹打細胞團混勻后，置37℃恒溫水浴箱低滲處理25分鐘。 
2.4 加入 1ml新配制的固定劑（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸管小心吹打、混勻，1000rpm離心8分鐘。 
2.5 棄上清液，加入8ml固定劑，吹打細胞團制成細胞懸液后，室溫下固定20分鐘。 
2.6 1000 rpm離心 8分鐘。 
2.7 棄上清液，重復固定一次。 
2.8 棄上清液，根據(jù)細胞數(shù)量的多少適當加入數(shù)滴新配制的固定劑，吹打細胞制成懸液。 
2.9 吸取少量原代細胞懸液，滴2～3滴于冰水浸泡過的載玻片上，吹散，氣干。 
2.10 將標本置Giemsa染液中，染色8分鐘，水洗去浮色，氣干。 
2.11 顯微鏡下觀察染色體標本分裂相的多少及分散情況。