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血液維生素B1液相色譜法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）
血液維生素B1液相色譜法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）
主要用途
血液維生素B1液相色譜法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)沉淀去除干擾，然后進(jìn)行氧化衍生化，進(jìn)而在液相色譜儀和熒光光譜下檢測(cè)分析，分離出維生素B1波峰，以定量測(cè)定樣品中TDP的含量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于人體、動(dòng)物等血液（紅細(xì)胞、全血）樣品中維生素B1的檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
維生素B1（vitamin B1），又稱為硫胺（thiamin），是一種B類復(fù)合物中的水溶性維生素，由嘧啶堿基（pyrimidine）和噻唑（thiazol）環(huán)通過(guò)亞甲橋（methylene bridge）鏈接而成?；瘜W(xué)全名是2-[3-[（4-amino- 2-methyl- pyrimidin- 5-yl） methyl]- 4-methyl- thiazol- 5-yl] ethanol。其分子量為300.84，分子式為C12H17N4OS+Cl-。維生素B1對(duì)于堿性溶液、氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)敏感。維生素B1由植物和微生物產(chǎn)生，以游離、肽結(jié)合、磷酯（phospho-ester）形式存在。而人體和動(dòng)物通過(guò)食物獲得補(bǔ)充，在胃腸組織通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸和被動(dòng)彌散予以攝入。其體內(nèi)代謝中的活化分子為焦磷酸硫胺（thiamine diphosphate/thiamine pyrophosphate；TDP）和三磷酸硫胺（thiamine triphosphate；TTP），作為碳水化合物、脂肪、醇類和氨基酸代謝（氧化羧基化反應(yīng)；oxidative carboxylation）的主要輔酶?；罨肿尤チ姿峄?，經(jīng)腎臟排出。全血中的90%或紅細(xì)胞中80%的維生素B1是TDP，因此檢測(cè)血液中TDP含量成為體內(nèi)維生素B1含量的主要指標(biāo)。維生素B1缺乏，將導(dǎo)致腳氣病（beriberi），而出現(xiàn)周圍神經(jīng)炎（peripheral neuritis）、肌無(wú)力、癱瘓和心血管系統(tǒng)癥狀。維生素B1的檢測(cè)方法，首先沉淀去除大分子干擾，然后使用鐵氰化鉀（potassium ferricyanide），在堿性條件下，氧化硫胺及其衍生物為熒光三色（trichrome）衍生物，進(jìn)而在液相色譜儀和熒光光譜儀下（激發(fā)波長(zhǎng)365nm，散發(fā)波長(zhǎng)440nm）檢測(cè)分析，分離出維生素B1波峰，以定量維生素B1的含量。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
沉淀液（Reagent C） 毫升
稀釋液（Reagent D） 毫升
堿性液（Reagent E） 毫升
氧化液（Reagent F） 毫升
流相液（Reagent G） 毫升
標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H） 毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書 1份
保存方式
保存稀釋液（Reagent D）、氧化液（Reagent F）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，氧化液（Reagent F）避免光照；試劑具有揮發(fā)性，注意密閉瓶蓋；沉淀液（Reagent C）、堿性液（Reagent D）、流相液（Reagent G）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證3月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品處理和標(biāo)準(zhǔn)液配制的容器
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品處理
恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于樣品反應(yīng)孵育
液相色譜儀（HPLC）：用于定量測(cè)定
實(shí)驗(yàn)步驟
一、樣品準(zhǔn)備
1）紅細(xì)胞樣品準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好EDTA抗凝管
2． 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
3． 轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
4． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為200g
5． 小心抽去上清液
6． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻
7． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為2000g
8． 小心抽去上清液
9． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟6至8二次
10．加入xx微升裂解液（Reagent B）
11．強(qiáng)力渦旋震蕩1分鐘
12．加入xx微升沉淀液（Reagent C）
13．渦旋震蕩1分鐘
14．4℃下孵育10分鐘
15．放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
16．小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
17．即刻進(jìn)行后續(xù)衍生化和液相色譜分析（注意：如果暫時(shí)保存，建議在4℃不超過(guò)24小時(shí)；-20℃不超過(guò)3月）
2）全血樣品準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好EDTA抗凝管
2． 抽取250微升血液，置于抗凝管里
3． 轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
4． 加入xx微升裂解液（Reagent B）
5． 強(qiáng)力渦旋震蕩1分鐘
6． 加入xx微升沉淀液（Reagent C）
7． 渦旋震蕩1分鐘
8． 4℃下孵育10分鐘
9． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
10．小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
11．即刻進(jìn)行后續(xù)衍生化和液相色譜分析（注意：如果暫時(shí)保存，建議在4℃不超過(guò)24小時(shí)；-20℃不超過(guò)3月）
二、測(cè)定準(zhǔn)備
1． 開啟儀器預(yù)熱15分鐘
2． 根據(jù)下表設(shè)置液相色譜儀（HPLC）參數(shù)
| 參數(shù) | 推薦三 | 補(bǔ)充說(shuō)明 |
| 色譜柱 | 長(zhǎng)度：12.5cm 直徑：4.0mm | Waters儀器或 Agilent儀器 |
| 固定相 | ODS | |
| 流動(dòng)相 | 流相液（Reagent G） | |
| 流速 | 1毫升/分鐘 | |
| 注射容量 | 50微升 | 10微升至100微升 |
| 檢測(cè) | 熒光 | |
| 波長(zhǎng) | 激發(fā)波長(zhǎng)365nm，散發(fā)波長(zhǎng)440nm | |
| 柱溫 | 30℃ | |
| 峰值時(shí)間（retention） | 3.5分鐘 | 參考 |
| 運(yùn)行時(shí)間 | 12分鐘 | 參考 |
3． 使用流相液（Reagent G）運(yùn)行1次（30毫升），以達(dá)到色譜柱均衡和溫度穩(wěn)定
三、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制
1． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
2． 分別加入xx微升稀釋液（Reagent D）到1至5號(hào)管
3． 移取xx微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1號(hào)管，混勻
4． 小心移取xx微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到2號(hào)管，混勻
5． 小心移取xx微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到3號(hào)管，混勻
6． 小心移取xx微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到4號(hào)管，混勻
7． 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
| 管號(hào) | 稀釋液（Reagent D） | 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H） | 標(biāo)準(zhǔn)TDP濃度 |
| 1 | xx微升 | xx微升 | 80納克/毫升 |
| 2 | xx微升 | xx微升1號(hào)管 | 40納克/毫升 |
| 3 | xx微升 | xx微升2號(hào)管 | 20納克/毫升 |
| 4 | xx微升 | xx微升3號(hào)管 | 10納克/毫升 |
| 5 | xx微升 | 0 | 0 |
8． 分別加入xx微升沉淀液（Reagent C）
9． 分別渦旋震蕩1分鐘
10． 4℃下孵育10分鐘
11． 分別放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
12． 分別移取上清液到新的1.5毫升離心管
13． 置于冰槽里備用
四、色譜分析
1． 分別移取xx微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）和待測(cè)樣品到新的1.5毫升離心管
2． 分別加入xx微升堿性液（Reagent E）
3． 分別加入xx微升氧化液（Reagent F），混勻
4． 放進(jìn)60℃培養(yǎng)箱孵育10分鐘
5． 置于冰槽里冷卻5分鐘
6． 分別放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
7． 分別移取上清液到新的1.5毫升離心管（注意：須在72小時(shí)內(nèi)完成測(cè)試）
8． 每次（每個(gè)樣品）注射50微升
9． 每次（每個(gè)樣品）運(yùn)行12分鐘
10．獲得色譜波峰圖：波峰面積（peak area）或峰值，保存記錄
11．全部運(yùn)行完成，使用30毫升無(wú)離子水清洗色譜柱
五、計(jì)算含量
1． 方法一：通過(guò)儀器中的軟件進(jìn)行測(cè)算
2． 方法二：構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為波峰面積（peak area）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)TDP濃度（納克/毫升），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)TDP濃度（納克/毫升）
3． 方法三：公式計(jì)算（選擇單一濃度的標(biāo)準(zhǔn)液）
樣本TDP濃度（納克/毫升）=【樣本波峰面積（peak area）X標(biāo)準(zhǔn)TDP濃度】÷對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)TDP濃度的波峰面積
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20次操作
2． 血漿或血清樣品的TDP含量較低，建議使用全血樣品為佳
3． 本產(chǎn)品檢測(cè)范圍是0.5至250納克/毫升
4． 操作時(shí)，須戴手套
5． 試劑具有揮發(fā)性，注意密閉瓶蓋或使用封口膜
6． 樣品建議新鮮采集，避免溶血
7． 正常人體血液中TDP的正常范圍為32至95納克/毫升；建議用戶建立自身正常范圍
8． 沉淀液（Reagent C）、堿性液（Reagent D）、流相液（Reagent G）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）具有腐蝕性，注意操作安全
9． 色譜柱的異物殘留、氣泡產(chǎn)生、溫度未達(dá)均衡等將導(dǎo)致異常波峰、時(shí)間偏移等
10．用戶可以使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)加入到樣品中，檢測(cè)回收率（recovery）
11．TDP的HPLC參考圖譜如下
12．TDP的出峰時(shí)間（retention）以用戶操作時(shí)，使用的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）實(shí)際出峰為準(zhǔn)
13．本公司提供系列維生素檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感
使用承諾
秉著“信譽(yù)至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說(shuō)明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題，請(qǐng)立即以書面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）與本公司，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。
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編號(hào) 名稱 規(guī)格
19067.2.2 血液維生素B1液相色譜法定量檢測(cè)試劑盒
19067.2.2A 清理液（Reagent A） 100毫升
19067.2.2B 裂解液（Reagent B） 100毫升
19067.2.2C 沉淀液（Reagent C） 10毫升
19067.2.2D 稀釋液（Reagent D） 10毫升
19067.2.2E 堿性液（Reagent E） 10毫升
19067.2.2F 氧化液（Reagent F） 10毫升
19067.2.2G 流相液（Reagent G） 500毫升
19067.2.2H 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H） 1毫升
| 產(chǎn)品編號(hào) | 名稱 | 規(guī)格 |
| 19067.2.1 | 通用型維生素B1液相色譜法定量檢測(cè)試劑盒 | 20次 |
| 19067.2.2 | 血液維生素B1液相色譜法定量檢測(cè)試劑盒 | 20次 |
| 19067.2.3 | 食物維生素B1液相色譜法定量檢測(cè)試劑盒 | 20次 |
| 19067.2.4 | 植物維生素B1液相色譜法定量檢測(cè)試劑盒 | 20次 |
| 19067.2.5 | 細(xì)菌維生素B1液相色譜法定量檢測(cè)試劑盒 | 20次 |
| 19067.2.6 | 酵母維生素B1液相色譜法定量檢測(cè)試劑盒 | 20次 |
| 19067.2.7 | 體液維生素B1液相色譜法定量檢測(cè)試劑盒 | 20次 |
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